Role of β1,3-galactosyltransférase 6 in the pathophysiology of a rare genetic disease, the Ehlers-Danlos syndrome
Rôle de la β1,3-Galactosyltransférase 6 (β3GalT6) dans la pathogénie d’une maladie génétique rare, les syndromes d’Ehlers-Danlos (SED)
Résumé
Proteoglycans (PGs) are major components of cell plasma membranes and extracellular matrix. These macromolecules play an important role in matrix organization of connective tissues and in cell signaling or embryonic and post-natal development. PGs are composed of glycosaminoglycan (GAG) chains covalently attached to a core protein through a tetrasaccharide linkage ßGlucuronic acid-ß1,3-Galactose-ß1,3-Galactose-ß1,4-Xylose-ß1-O-ß. The addition of the third residue (galactose) is catalyzed by the ß1,3-Galactosyltransferase 6 (ß3GalT6), a key glycosyltransferase in GAG initiation. Our group and others discovered that mutations of ß3GalT6 are associated to a spondylodysplastic form of Ehlers-Danlos Syndrome (spEDS), a severe connective tissue disorder characterized by skin and bone fragility, musculoskeletal malformations, delayed wound healing, joint hyperlaxity and intellectual disabilities. The objectives of this project is to understand the functional and structural consequences of ß3GalT6 mutations in the development of spEDS, (i) achieving the molecular and functional characterization of the recombinant human β3GalT6 and (ii) to develop cellular models (as ß3GalT6 KO cells) to study the impact of genetic deficiency on cells metabolism, precisely on GAGs synthesis. The first part of the project is dedicated to the determination of mutation impact on the ß3GalT6 function. For this, we produce and purify several truncated soluble forms of hß3GalT6 in fusion to Maltose Binding Protein. The enzymatic activity tests have determined a KM of 30 µM and a kcat of 0,05 min-1 on wild-type enzyme. ß3GalT6 mutants will be further analyzed using the same approach. The second part of the project is achieving to develop a ß3GalT6 deficient cell model using the CRISPR/Cas 9 technology. Deficient clones obtained present (i) a low level of RNA expression, (ii) an absence of galactosyltransferase activity and (iii) a defect on endogenous GAG synthesis or with exogenous substrate. We also analyze the capacity for WT β3GalT6 and two mutants (Asp207His and Gly217Ser) to restore GAGs synthesis in deficient cells. From this work, we better understand the implication of β3GalT6 in the pathology of spEDS and relationships between ß3GalT6 loss of function, cellular consequences of genetic defect. Those results linked with the severity of spEDS clinical symptoms observed in patients, would help clinicians with management and clinical monitoring of spEDS patients.
Les protéoglycanes (PGs) sont des composants majeurs de la matrice extracellulaire et jouent un rôle important dans l’organisation architecturale des tissus conjonctifs et dans la signalisation cellulaire. Les PGs sont composés de chaînes de glycosaminoglycanes (GAGs) attachées de façon covalente à une protéine core par une amorce tétrasaccharidique. L’addition du troisième résidu (galactose) est catalysée par la β1,3-galactosyltransférase 6 (β3GalT6), une enzyme clé de l’initiation de la synthèse des GAGs. Plusieurs études ont mis en évidence la présence de mutations de la β3GalT6 associées à la forme spondylodysplastique du Syndrome d’Ehlers-Danlos (SEDsp), une maladie génétique sévère des tissus conjonctifs et caractérisée par une fragilité des tissus, une hyperlaxité articulaire, une hyperextensibilité et des défauts de cicatrisation de la peau ainsi que des altérations du système musculo-squelettique. L’objectif de ce travail de thèse est de comprendre les conséquences fonctionnelles et structurales des mutations de la β3GalT6 et leur rôle dans la pathogénie du SEDsp, (i) en réalisant une caractérisation moléculaire et fonctionnelle de la protéine recombinante humaine et (ii) en développant un modèle cellulaire déficient en β3GalT6 pour étudier l’impact des défauts génétiques sur les fonctions métaboliques des cellules, en particulier sur la synthèse des GAGs. La première partie du projet vise à la détermination de l’impact des mutations sur la fonction de la β3GalT6. Pour ce faire, nous avons produit dans la bactérie et purifié différentes formes tronquées solubles de la β3GalT6. Les essais enzymatiques ont permis de déterminer les constantes cinétiques KM et kcat de la protéine sauvage. La seconde partie de ce travail de thèse a été de réaliser un modèle cellulaire déficient en β3GalT6 en utilisant la technologie CRISPR/Cas9. Les clones déficients obtenus présentent (i) un très faible niveau d’expression de l’ARNm, (ii) une absence d’activité galactosyltransférase et (iii) un défaut de synthèse des GAGs endogènes ou à partir d’un substrat exogène xylosidique. A partir de ce travail, nous avons acquis une meilleure compréhension de l’implication de la β3GalT6 et du le lien entre la perte de fonction de la β3GalT6 et les conséquences métaboliques et cellulaires de cette déficience génétique. Ces résultats devraient aider les cliniciens dans la prise en charge et le suivi clinique des patients atteints de SEDsp.
| Origine | Fichiers produits par l'(les) auteur(s) |
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