Development of new fluorophores for site-specific DNA labelling : applications to fluorogenic detection of nucleic acids
Développement de nouveaux fluorophores pour le marquage site-spécifique de l'ADN : applications à la détection fluorogénique des acides nucléiques
Résumé
The design of new fluorophores is now essential for the development of imaging of biological systems and more particularly of nucleic acids in order to better understand their implications in life. This type of probe requires precise photophysical parameters such as red-shifted absorption and emission wavelengths as well as good photostability. Today, fluorogenic probes are among the most promising systems for nucleic acid imaging. Systems that allow to switch from a single strand of non-fluorescent nucleic acid to a fluorescent duplex after hybridization allow to reduce considerably the background noise while keeping a low complexity system. In this thesis, we report the development and characterization of 14 novel fluorogenic probes that were linked by CuAAC reactions to multiple DNA sequences. These allowed us to study fluorogenic amplifications after hybridization of the single strand to its target. Several strategies were used to increase these amplifications. We studied several families of molecules using various fluorogenic mechanisms. It turned out that the probes derived from Miami Green best meet the specifications we had set ourselves. Its absorption and emission wavelengths are strongly red-shifted while keeping a very large Stokes shift and exhibiting good photostability. Above all, these probes have allowed us to obtain fluorescence amplification higher than a factor of 30 during the formation of a DNA duplex. These promising results offer new perspectives for classical and super-resolution imaging applications.
La conception de nouveaux fluorophores est aujourd'hui essentielle pour le développement de l'imagerie des systèmes biologiques et plus particulièrement des acides nucléiques afin de mieux comprendre leurs implications dans le vivant. Ce type de sonde exige des paramètres photophysiques précis comme des longueurs d'onde d'absorption et d'émission décalées vers le rouge ainsi qu'une bonne photostabilité. Aujourd'hui les sondes fluorogéniques font partie des systèmes les plus prometteurs pour l'imagerie des acides nucléiques. Les systèmes permettant de passer d'un simple brin d'acide nucléique non-fluorescent à un duplexe fluorescent après l'hybridation permet de réduire considérablement le bruit de fond tout en gardant un système peu complexe. Dans cette thèse, nous rapportons le développement et la caractérisation de 14 nouvelles sondes fluorogéniques qui ont été liées par des réactions de CuAAC à de multiples séquences d'ADN. Celles-ci nous ont permis d'étudier les amplifications fluorogéniques après hybridation du simple brin à sa cible. Plusieurs stratégies ont été utilisées pour accroitre ces amplifications. Nous avons étudié plusieurs familles de molécules utilisant des mécanismes fluorogéniques variés. Il s'est révélé que les sondes dérivées de la Miami Green répondent aux mieux au cahier des charges que nous nous étions fixés. Ses longueurs d'ondes d'absorption et d'émission sont fortement décalées vers le rouge tout en gardant un très large déplacement de Stokes et une bonne photostabilité. Par-dessus tout, ces sondes ont permis l'obtention d'amplifications de fluorescence les plus importantes avec à un facteur jusqu'à 30 lors de la formation d'un duplexe d'ADN. Ces résultats très prometteurs offrent de nouvelles perspectives pour des applications en imagerie classique ou de super résolution.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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