Active site remodeling in glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenases through evolution and protein engineering
Remodelage du site actif des Glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénases au cours de l'évolution et par ingénierie protéique
Abstract
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Le premier volet de cette thèse avait pour but de caractériser l'activité de la protéine codée par le gène gapB d'Escherichia coli. En effet, E. coli est un cas particulier au niveau des gènes gap (gène codant pour la GAPDH), puisqu'il en contient deux. Le premier, appelé gapA, code pour l'activité GAPDHase, alors que le second, appelé gapB et qui exprime habituellement l'activité GAPDHase dans les eubactéries, ne remplit pas ce rôle chez E. coli. Une étude récente le décrivait comme exprimant.une activité érythrose 4-phosphate déshydrogénase (E4PDHase) non phosphorylante, essentielle pour la biosynthèse du pyridox phosphate. Notre étude a permis de montrer que la protéine GAP B possède une activité E4PDHase non phosphorylante efficace et phosphorylante non efficace, alors que ses activités GAPDHase phosphorylante et non phosphorylante ne sont pas efficaces. [...] Le second volet de cette thèse consistait à remplacer la cystéine essentielle de la GAPDH de B. stearothermophilus soit par un moins bon nucléophile, en l?occurrence une sérine, soit par un meilleur nucléophile, une sélénocystéine. Le but de ce travail était d'étudier l'influence du contexte protéique du site actif de la GAPDH, d'une part sur la nucléophilie du résidu introduit, et d'autre part sur l'efficacité catalytique de ces mutants. [...]