Production et glycosylation d'EPO par cellules CHO : caractérisation par électrophorèse capillaire au cours de procédés discontinus - Université de Lorraine Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2003

Production and glycosylation of erythropoietin by Chinese Hamster Ovary cells : caracterization by capillary electrophoresis during batch processes

Production et glycosylation d'EPO par cellules CHO : caractérisation par électrophorèse capillaire au cours de procédés discontinus

François Le Floch
  • Fonction : Auteur
  • PersonId : 788522
  • IdRef : 077630777

Résumé

The scope of this work is to improve the control of the glycosylation of recombinant proteins produced by animal cell culture by studying the influence of the culture process on the glycan structure of a model protein : CHO cell produced EPO. For building the system, several step were necessary : the generation of a high-EPO-producer CHO cell clone, the set-up of an immuno-affinity purification method and the adaptation of a technique for analysis of protein glycosylation to our system constraints. Then, two parameters of the culture process were studied more precisely : the culture time and the presence of serum. By monitoring EP9 glycosylation in the course of serum-containing batch cultures, we observed a progressive desialylation of the protein during the second part of the culture and an important cell lysis. Since a significative siaiidase activitv was also found in the same time, this phenomenon seemed to be induced by an enzymatic degradation following cell lysis in serum-containing cultures. On the other band, after serum-free adaptation, EPO sialylation was found constant during the whole serum-free cultures. Anaiysis of EPO glycosylation produced in serum-containing medium by serum-free adapted cells showed that the occurring desialylation was directly linked to the presence of serum and not to the serum-free adaptation procedure. To conclude, this work clearly shows the important influence of sorne process parameters on the quality of EPO when produced in our system.
Ce travail a pour objectif d'améliorer la maîtrise de la glycosylation des protéines recombinantes produites par culture de cellules animales, ceci par l'étude de l'influence du procédé de culture sur la structure glycannique d'une protéine modèle: l'érythopoïétine (EPO) produite par cellules CHO. La construction du système d'étude a d'abord nécessité plusieurs étapes: la génération d'un clone CHO producteur d'EPO performant, la mise au point d'une méthode de purification de la protéine par immuno- affinité et l'adaptation d'une technique d'analyse de la glycosylation aux contraintes de notre système. Deux paramètres particuliers du procédé de culture ont donc été plus précisément étudiés au cours de ce travail: l'avancement de la culture et la présence de sérum dans le milieu. L'étude du suivi de la glycosylation de l'EPO en cours de culture discontinue avec sérum a mis en évidence une désialylation progressive de la protéine durant la deuxième partie de la culture, de même qu'une lyse cellulaire importante. Une activité sialidasique significative ayant également été observée simultanément, une dégradation enzymatique faisant suite à la lyse cellulaire semble être à l'origine de ce phénomène en présence de sérum. Après adaptation des cellules au milieu sans sérum, la désialylation de l'EPO s'est par contre révélée stable tout au long des cultures réalisées en l'absence de sérum. L'étude de la glycosylation de l'EPO produite en présence de sérum par des cellules adaptées à la culture sans sérum a montré que la désialylation de l'EPO était directement liée à la présence de sérum, et non à la procédure d'adaptation des cellules au milieu sans sérum. En conclusion, cette étude a mis en évidence l'influence significative que pouvait avoir certains paramètres du procédé de culture sur la qualité de l'EPO produite par notre système.
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Dates et versions

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Identifiants

  • HAL Id : tel-01749708 , version 1

Citer

François Le Floch. Production et glycosylation d'EPO par cellules CHO : caractérisation par électrophorèse capillaire au cours de procédés discontinus. Alimentation et Nutrition. Institut National Polytechnique de Lorraine, 2003. Français. ⟨NNT : 2003INPL079N⟩. ⟨tel-01749708⟩
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