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,
, Cyclin A is required in S phase in normal epithelial cells, Biochem. Biophys. Res. Commun, vol.182, pp.1144-1154
, Les femelles gravides sont euthanasiées par asphyxie à l'aide de gaz CO 2 comprimé
, Poser le dos des animaux sur le tampon absorbant et tremper dans de l'éthanol à 70% pour réduire le risque de contamination de la dissection avec les poils de la souris
, Pincer la peau et de faire une petite incision latérale à la ligne médiane avec des ciseaux chirurgicaux. Tenir fermement la peau dessus et en dessous de l'incision et tirer la peau en dehors vers la tête et la queue afin d
, Saisir le péritoine avec une pince forceps (n°5, Moria SA
, Sortir le chapelet d'embryons contenus dans les deux cornes utérines de la femelle gestante
, Couper l'artère utérine pour libérer le chapelet d'embryons
, Noter la présence éventuelle d'embryons réabsorbés et les compter
, Ouvrir aux ciseaux la corne utérine sur toute sa longueur pour libérer les embryons. Séparer les embryons individuels. Chaque embryon se trouve dans son propre sac vitellin et possède un placenta
, Avec les pinces, pincer le sac vitellin et l'ouvrir. Alternativement, ouvrir le sac vitellin avec les ciseaux
, Couper l'artère ombilicale avec les ciseaux pour libérer l'embryon
, Jeter le sac vitellin, conserver l'embryon et le placenta, les peser. Photographier les embryons pour documenter d'éventuelles anomalies macroscopiques
, Nettoyer très soigneusement les pinces forceps d'abord au détergent puis à l'éthanol 70%, afin d'éviter toute contamination par des cellules maternelles lors du prélèvement de la queue des embryons. Prélever la queue de chaque embryon
, Pour les embryons E15.5 et stades ultérieurs, ouvrir la nuque et le bas de la colonne vertébrale avec les pinces ou les ciseaux, pour que le fixateur pénètre correctement. Pour les stades antérieurs, la pénétration est correcte sans faire ces ouvertures
, Placer les embryons dans des tubes à hémolyse contenant un volume de fixateur (paraformaldéhyde 4% dilué en PBS) dix fois supérieure au volume de l'échantillon à fixer
, Incuber à 4°C sous agitation pendant 4heures
, de PBS 1X) à 4°C sous agitation, jusqu'à ce que l'échantillon tombe au fond du tube, ce qui indique que les tissus sont gorgés de sucrose
, Rincer 3 fois au PBS 1X pendant 5 minutes sous agitation. Eponger sur un papier absorbant
, Procéder à la préparation et l'inclusion de l'embryon en paraffine ou en milieu cryoprotecteur
, Vidéos d'isolement d'embryons de souris
, , vol.5
, , vol.5
, Figure : Position des noeuds par rapport aux lobes hépatiques
, Fiche 3 : Prélèvement et gestion des échantillons
Ouvrir la cage thoracique. Prélever le sang par ponction intracardiaque ,
, Sang: mettre dans un tube hépariné sur la glace fondante
, Décanter immédiatement (3500 rpm, 10 min, 4°C)
, Eviter les plasmas hémolysés
MMA, méthionine (idéal = 100 µL, minimum = 30 µL) ,
Si des différences (taille, couleur, morphologie?) sont observées à l'oeil nu entre les KO et WT, il est possible de prendre des photos pour illustrer cela ,
, Mettre une moitié de lobe gauche latéral hépatique dans le paraformaldéhyde (PAF) 4% en PBS dans la glace
, L'autre moitié de lobe gauche latéral hépatique est placée dans un tube 1,5 ml ou 2 ml qui est congelé immédiatement à l'azote liquide
Séparer le coeur droit du coeur gauche, p.4 ,
, Dosages plasmatiques / sériques et tissulaires 1. Dosage de l'homocystéine, acide methylmalonique et acide succinique par LCMS/MS, Fiche, vol.4
, L'extraction est effectuée dans un tampon hypotonique (PBS 0.1%, 2% d'inhibiteurs de protéases) (Protease Inhibitor Cocktail for mammalian tissues, Sigma-Aldrich). La lyse est réalisée à l'aide d'un sonicateur à sonde (Cell sonifier disruptor, Branson®). L'homocystéine nécessite une étape de traitement au DTT (Sigma-Aldrich)pour rompre les liaisons aux protéines. Le surnageant récupéré par centrifugation de 30min à, Les dosages biochimiques sont réalisés sur des plasmas non traités ou acidifiés pour certains métabolites comme l'homocystéine, 20000.
, L'homocystéine liée aux protéines est libérée par ajout d'un réducteur. Les protéines sont précipitées au méthanol. Les standards internes deutérés sont ajoutés et quelques ?L sont injectés dans l'UPLC
, La quantification est faite grâce à une gamme d'étalonnage en plasma et à ajustement interéchantillon grâce aux standards deutérés ajoutés en concentration connue et constante
, Ce dosage a été réalisé en collaboration avec le laboratoire de biochimie et de biologie moléculaire du
, Préparation des réactifs : -Préparation d'aliquots de solutions mères standards non deutérées et deutérées à 1 mmol/L. a. Standards SAM et SAH
, Tous les produits sont fournis par Sigma-Aldrich
,
, Détecteur à fluorescence Shimadu RF10AXL (278nm:Ex/418nm:Em). g. Intégrateur: logiciel Borwin 3.1. h. Four à colonne, vol.100
Le cholestérol libre produit est oxydé par la cholestérol oxydase (CHO) pour former du cholestène-3-one, avec production simultanée de peroxyde d'hydrogène (H2O2) qui s'allie par oxydation avec la 4-aminoantipyrine et le phénol en présence de la peroxydase (POD) et produit un chromophore ,
Le principe de la méthode consiste à mesurer l'activité enzymatique de l'ALAT à partir de 2 réactions successives. La première transforme la Lalanine en pyruvate via l'ALAT, la seconde permet la transformation du pyruvate en L-lactate en utilisant comme co-facteur le NADH. La diminution de l'absorbance due à la conversion du NADH en NAD+, proportionnelle à l'activité ALAT dans l'échantillon, est mesurée à 340 nm. Le dosage de l'Aspartate AminoTransférase (ASAT) est réalisé selon la méthode développée par Henry. Comme pour le dosage de l'ALAT, Le principe de la méthode consiste à mesurer l'activité enzymatique de l'ASAT à partir de 2 réactions successives, 1960. ,
, Equilibrer les colonnes (4) par des lavages successifs
, CH 3 ] méthionine produite a été mesurée sur un analyseur (7) TRI-CARB, 1900.
,
, DTT(H2O), Na/Ascorbate(H2O), SAM(H2O)
,
, Colonne AG1x8, résine cationique échangeuse d'anions Cl-: Bio-Rad Laboratories, (Marnes-la
,
, PicoFluor : agent de scintillation, Etats-Unis). Colonnes AG 1-X8 BioRad Laboratories
, , 1990.
, Electrophorèse Agarose, vol.1, p.5
, Rincer le flacon erlenmeyer (250 mL) + cuve + support + peigne à l'eau distillée
, Peser 1,2 g d'agarose (balance Sartorius) et mettre dans l
, Chauffer au four micro-ondes jusqu'à ébullition vive
, Ajouter 1 goutte de Bromure d'ethidium (BET, très toxique !) et laisser tiédir
, Poser un papier aluminium sur sur l'Erlenmeyer et agiter doucement à la main
, Verser le gel liquide sur le support (attention aux fuites)
, Laisser refroidir, pendant ce temps préparer les échantillons (tubes 0, vol.5
, Fiche 6 : Extraction de l'ARN par TRIzol (Invitrogen)
, Lyse et homogénéisation de l'échantillon
, Dans des microtubes type SafeLock ou SafeSeal de 1.5 mL, ajouter 1 mL de TRIzol pour 50-100 mg de tissu (ne pas vortexer les ARN)
, Séparation des phases
, Incuber l'échantillon homogénéisé 5 min à température ambiante (dissociation des complexes nucléoprotéiques)
, Ajouter 0.2 mL de chloroforme pour 1 mL de TRIzol (bien vérifier que les tubes sont fermés)
, Note : Le mélange est séparé en 2 parties : une phase inférieure contenant le
,
, Note : Il est possible de réeffectuer une séparation en ajoutant, Transférer la phase aqueuse dans un nouveau microtube
, Précipitation de l'ARN
, Ajouter 0.5 mL d'isopropanol 100% (=alcool isopropylique = propanol-2) à la phase aqueuse pour 1 mL de TRIzol utilisé
, Incuber 10 min à température ambiante, agiter doucement à la main régulièrement
, Note : L'ARN est souvent invisible avant la centrifugation, ensuite il forme un culot sur le côté au fond du tube après la centrifugation, Centrifuger à 12,000 g/4°C/10 min
, Note : L'ARN peut être stocké dans l'éthanol 75% au moins 1 semaine à 4°C ou plus d
, Agiter l'échantillon brièvement et centrifuger le tube à 7,500 g/4°C/5 min. Eliminer le surnageant. Note : il est possible d'effectuer un deuxième lavage à l'éthanol 75%
, Sécher à l'air libre pendant 5-10 minutes : tube retourné sur un papier absorbant. Note: Ne pas sécher complètement au risque de rendre l'ARN insoluble. Les ARN partiellement solubilisés ont un ratio A260/280 <1.6
, Conserver les ARN à -80°C
, Quantification de l'ARN et Contrôle de qualité de l'ARN 1. Quantification de l'ARN par Nanodrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer, vol.7, 2010.
, Pour commencer, nettoyer les surfaces supérieures et inférieures optique du système de spectrophotomètre par pipetage de 2 à 3 µL d'eau déminéralisée propre sur la surface inférieure optique
, Fermer le bras de levier, s'assurert que le piédestal supérieur vient en contact avec l'eau déminéralisée. Soulever le bras de levier et essuyer les surfaces optiques avec un chiffon propre, sec
, Utiliser une micropipette calibrée pour effectuer un essai à blanc en déposant 1 µl de tampon sur la surface inférieure optique. Abaisser le bras de levier et sélectionner "blanc, Ouvrir le logiciel NanoDrop et sélectionner l'application des acides nucléiques
, Une fois l'essai à blanc terminé, nettoyer les deux surfaces optiques avec un chiffon propre, sec, non pelucheux
, Choisir la constante appropriée à l'échantillon qui doit être mesuré
, Déposer 1 µl d'échantillon d'acides nucléiques sur la partie inférieure du piédestal optique et fermer le bras de levier. Parce que la mesure est indépendante du volume, l'échantillon doit seulement combler le fossé entre les deux surfaces optiques pour la mesure
, Le logiciel calcule automatiquement le taux de concentration d'acides nucléiques et de pureté. Suite à la mesure de l'échantillon, faire l'examen de l'image spectrale pour évaluer la qualité de l'échantillon, Sélectionner "mesure" dans le logiciel d'application
, Un échantillon d'acides nucléiques typiques a un profil très caractéristique
, Dans le cas de l'extraction phénol / Trizol, la contamination résiduelle peut être indiquée par des spectres anormaux entre 220 à 240 nm ainsi que par des changements dans la région 260-280 nm. Inversement, la guanidine résiduelle provenant de l'extraction de colonne peut contribuer à un pic de près de 230 nm et un, Les sources communes de polluants associés à des techniques d'isolement d'acides nucléiques comprennent l'extraction phénol / Trizol et la colonne
, Pour évaluer avec précision la qualité des échantillons
, Les acides nucléiques purs ont généralement un ratio 260/280 ~ 1,8 et un ratio de 260/280 de ~ 2.0 pour l'ADN et l'ARN, respectivement. Ce ratio est dépendant du pH et de la force ionique du tampon utilisé pour faire le blanc et les mesures d'échantillons. Des ratios de pureté qui sont nettement inférieurs aux valeurs attendues peuvent indiquer que la technique d, doivent être analysés en combinaison avec la qualité spectrale globale
, Vérification de qualité des ARN avec le Bioanalyzer Agilent
Agilent) est une plateforme qui permet de séparer des échantillons par électrophorèse en vue de leur contrôle-qualité ,
, Réactifs et matériels : 1. Bioanalyzer 2100 Agilent 2. RNA 6000 Nano Kit 3, pp.5065-4476
, Echantillons à doser (12 échantillons/puce)
, RNA, vol.6000
, A réception du kit, le « ladder » peut être conservé à -20 °C jusqu'à sa préparation. b. Pour préparer le « ladder », le décongeler et le dénaturer 2 min à 70 °C puis le placer immédiatement sur glace, Faire des aliquots de 1,5 ?L dans des tubes eppendorf de 0,5 mL. Les aliquots sont conservés à -80°C
, Préparation du matériel a. Sortir le RNA 6000 Nano Assay Kit à température ambiante, 30 min avant utilisation
, RNA gel matrix filtré : Placer 550 ?L de RNA gel matrix sur la colonne de filtration. Centrifuger 10 min à 4000 rpm (1500 rcf), Conserver un mois à 4 °C
, Gel-dye mix : Mettre 65 ?L de RNA gel matrix filtré dans un tube Eppendorf de 1,5 mL et rajouter 1 ?L de RNA dye concentré ? Vortexer Centrifuger 10 min à, vol.12, p.0
, Conservation du gel-dye mix 2 jours à 4 °C, à l'abri de la lumière
, Décongeler le RNA 6000 Ladder sur glace b. Incubation des échantillons et du ladder (optionnel pour le ladder), 2 min à 70 °C, Préparation des échantillons et du marqueur de taille a
, Placer immédiatement les tubes sur glace. Les centrifuger (les conserver sur la glace)
, Couler le gel a. Placer la seringue sur La station. b. Régler la seringue sur 1 mL
, Déposer 9 ?L de Gel-dye mix dans le puits G de la puce (ne pas introduire de bulles d'air !) d. Placer la puce dans La station
, Fermer La station er presser doucement sur la seringue jusqu'au « clip
, Attendre exactement 30 secondes
Laisser la position de la seringue remonter doucement (jusqu'à la graduation 0,8 mL environ), remonter doucement le piston de la seringue à 1 mL ,
, Ouvrir La station
, Déposer 9 ?L de Gel-dye mix dans les deux puits notés G de la puce
, Pour sauvegarder les données
, Cocher PDF puis « save as » sur le support le plus approprié (clé USB, serveur
, Transcription inverse des ARN (RT), vol.8
, La transcription inverse correspond à la synthèse de l'ADN monocaténaire
ARN monocaténaire servant de modèle, et ce, par le biais de transcriptases inverses (RT). L'ADNc peut être utilisé en tant que matrice à des fins d'amplification par PCR ou en vue de générer une bibliothèque d'ADNc. Cette réaction est catalysée par l'ARN polymérase ADN dépendante ,
, Sur un volume d'ARN équivalent à 1?g par échantillon, compléter avec de l'eau (RNasefree) jusqu'à 12?l
, Ajouter dans chaque tube 2?l de tampon gDNA Wipeout® pour éliminer l'ADN génomique
, Incuber 2 minutes à 42°C au Thermocycleur et mettre les tubes rapidement dans la glace
, , vol.de réaction, p.20
, Placer dans le Thermocycleur préchauffé et sélectionner le programme RT :15 min à 42°C, 3 minutes à 95°C
, Faire des aliquotes et Conserver les ADNc produit à -80°C
, La RT a été faite par QuantiTect Reverse Transcription Kit de QIAGEN Fiche 9 : PCR quantitative en temps réel
, La réaction en chaîne par polymérase en temps réel (PCR en temps réel) est une technique ayant de nombreuses applications, basée sur une réaction enzymologique, la PCR
, À chaque cycle d'amplification, la quantité d'ADN total ou d'amplicon est mesurée grâce à un marqueur fluorescent. L'obtention de la cinétique complète de la réaction de polymérisation permet d'obtenir une quantification absolue de la quantité initiale d'ADN cible, ce qui était très difficile à obtenir sans biais en PCR en point final
Des sondes fluorescentes se fixent soit sur l'ADN double brin (technologie SYBR) ou sur une séquence d'ADN précise (technologie Taqman et Beacon). Ces sondes ne fluorescent qu'une fois fixées à l'ADN (soit à cause d'un "quencher ,
, Une fois que la quantité d'ADN permet aux sondes fluorescentes de dépasser ce seuil alors on obtient un numéro de cycle PCR appelé "Ct"pour "Cycle Threshold" ou cycle seuil. C'est cette valeur qui est à la base des calculs pour quantifier l'ADN de façon absolue ou relative. Il est important de connaître l'efficacité E de la PCR. Pour cela, on effectue une PCR en temps réel sur des échantillons de dilution croissante pour obtenir un courbe étalon
,
, Décongeler les échantillons d'ADNc dans la glace, le master mix
, Préparer un mix selon le tableau suivant
, Dénaturation initiale et activation de l'enzyme : 95°C/30sec
, cycles de dénaturation et hybridation/élongation : 95°C/5sec + 60°C(pol II, RSP 29) 63°C (MTR)/30sec
, Dosage des protéines par la méthode de l'acide bicinchoninique, Fiche, vol.11
, Ce dosage est réalisé à l'aide du kit Pierce BCA Protein Assay® Reagent 1)
, ?g/mL, en triple) à partir d'une solution stock de BSA (bovine serum albumin) diluée dans la même solutionque les échantillons à doser, vol.50, 1200.
, Mesurer l'absorbance sur un spectrophotomètre lecteur de plaques à 570 nm
, La droite de régression étalon est tracée et la concentration protéique des échantillons estdéduite à partir de la courbe étalon
,
, Ampoule contenant de la BSA à 2,0 mg/mL dans une solution de NaCl à 0,9% (p/v)
, Réactif A : solution aqueuse contenant BCA-Na2 1% (p/v), Na2CO3 2% (p/v), vol.16, p.25
,
, Chauffer le tampon entre 37°C et 40°C
, Sous hotte, remplir un bac en verre de tampon chaud 3. Immerger les membranes pendant 30 mn à 40°C en agitant de temps en temps 4. Rincer rapidement les membranes à l'eau distillée
, Rincer ensuite avec du TBST 2x10 mn sous agitation
, , p.20
, Tris HCL pH, vol.6, issue.7, p.2
, NaCl, vol.1, p.5
, Analyses histologiques 1. Traitement des échantillons tissulaires pour l'analyse histologique, vol.14
, Déshydratation et inclusion en paraffine
, Après fixation, les tissus sont placés dans des cassettes. Ils sont ensuite déshydratés et imprégnés
Une fois que le tissu est correctement positionné, le moule est placé sur une plaque refroidissante afin de faire durcir la paraffine, vol.1 ,
, Des coupes de 5 µm d'épaisseur sont réalisées au microtome
, Automate tissue-Tek DRS
,
, Tous les produits sont fournis par VWR Prolabo
,
, Eau acétifiée
,
,
,
, Marquages immunofluorescents
, A la suite de cette étape, les lames subissent un démasquage des sites antigéniques. Pour cela, elles sont incubées dans du tampon EDTA-Na 2 10 mM à pH = 8 pendant 30 minutes à 95°C, puis les bacs contenant les lames sont placés dans la glace pendant 20 minutes. Les lames sont ensuite lavées plusieurs fois dans du PBS 1X. Après l'étape de lavage, les sites non spécifiques sont bloqués à l'aide d'une solution composée d'un mélange de BSA 10% -sérum de cheval 5% -PBS 1X ou une solution de BSA 10% -PBS 1X ou encore du sérum de veau 10% -PBS 1X (selon les mises au point) pendant 1 heure à température ambiante. L'anticorps primaire est ensuite ajouté puis incubé pendant 1 nuit à 4°C. Le lendemain, les lames sont rincées plusieurs fois avec du PBS, puis l'anticorps secondaire (Alexa fluor 488 donkey anti-rabbit IgG, Molécular Probes) est déposé et incubé pendant 1h30 à température ambiante, Après avoir subi une étape de déparaffinage dans une solution Histo-clear (National Diagnostics, HS-200), les lames sont réhydratées par incubation dans des bains d'alcools de degré décroissant (100%, 95%, 70% et 50%) puis dans un bain d'eau distillée
, Marquage immunohistochimiques
, A la suite de cette étape, les lames subissent un démasquage des sites antigéniques. Pour cela, elles sont incubées dans du tampon EDTA-Na 2 10 mM à pH = 8 pendant 30 minutes à 95°C, puis les bacs contenant les lames sont placés dans la glace pendant 20 minutes. Les lames sont ensuite lavées plusieurs fois dans du PBS 1X. Après l'étape de lavage, les sites non spécifiques sont bloqués à l'aide d'une solution composée d'un mélange de BSA 10% -sérum de cheval 5% -PBS 1X ou une solution de BSA, Après avoir subi une étape de déparaffinage dans une solution Histo-clear (National Diagnostics, HS-200), les lames sont réhydratées par incubation dans des bains d'alcools de degré décroissant (100%, 95%, 70% et 50%) puis dans un bain d'eau distillée
, Etude transcriptomique L'étude transcriptomique a comporté les étapes suivantes, vol.16
, Analyse quantitative et qualitative des ARN par Bioanalyzer (Agilent Technologies
, selon le protocole du fournisseur. L'hybridation sur puces GeneChip® Mouse Gene 2.0 ST Array (Affymetrix, Le traitement des ARN et le marquage des acides nucléiques ont été réalisés avec le GeneChip® WT PLUS Reagent Kit (Affymetrix
, Analyse bioinformatique : ? Correction et normalisation avec la suite Partek
, ? Analyse statistique de l'expression différentielle avec le logiciel libre de traitement des données et d'analyse statistiques R
Protein ANalysis THrough Evolutionary Relationships, www.pantherdb.org , laboratoire du Pr, ? Analyse des voies et des gènes dérégulés avec le logiciel PANTHER, 2013. ,