How to produce your furanocoumarins : the hidden pathway ~ From the characterisation of new P450s to the evolution of the furanocoumarin pathway and the development of tools allowing the study of furanocoumarins’ metabolic cost - Université de Lorraine Access content directly
Theses Year : 2020

How to produce your furanocoumarins : the hidden pathway ~ From the characterisation of new P450s to the evolution of the furanocoumarin pathway and the development of tools allowing the study of furanocoumarins’ metabolic cost

À la croisée des voies, ou comment produire des furocoumarines ~ De la caractérisation de P450s à l’évolution de la voie des furocoumarines et au développement d’outils permettant l’étude du coût métabolique des furocoumarines

Abstract

To cope with pests and pathogens, plants have evolved many defence mechanisms such as the production of various specialised metabolites. For instance, some species including the fig tree (Ficus carica) produce toxic molecules called furanocoumarins. As the use of pesticides is being restricted, these age-old adaptations represent an interesting source of inspiration to find crop protection alternatives. Therefore, improving our understanding of plant defences becomes essential to rethink our crop management strategies. The first objective of this project was to pursue the molecular elucidation of the furanocoumarin biosynthesis pathway and to gain evolutionary insights through the characterisation of new genes in F. carica. The second objective was to assess the metabolic cost of furanocoumarin production by inserting the associated pathway in the genome of tomato (Solanum lycopersicum), a plant that does not naturally produce these molecules. To identify new genes involved in the furanocoumarin biosynthesis, we combined transcriptomic and metabolomic approaches: we identified candidate genes in a F. carica differential RNAseq database, cloned their coding sequences, heterologously expressed them, and performed enzymatic assays. This led us to identify three enzymes with original activities. Among these, CYP76F112 plays a key role in the furanocoumarin biosynthesis by converting demethylsuberosin into marmesin with a very high affinity. A phylogenetic gene-family analysis strongly suggests that CYP76F112 evolved recently in a restricted taxon of the Moraceae family, through an expansion of the CYP76Fs. Modelling and site-directed mutagenesis experiments permitted to highlight four amino acids that impact CYP76F112 specificity and affinity. Moreover, the recent evolution of these amino acids has most certainly been critical for the emergence of the marmesin synthase activity. Therefore, CYP76F112 significantly improves our understanding of furanocoumarin production in higher plants, since its recent evolution supports the hypothesis that furanocoumarins have appeared by convergent evolution in distant plant families. In addition, as CYP76F112 completes the set of four enzymes that allow the conversion of coumaric acid (a common molecule) into psoralen (a toxic furanocoumarin), it opens new horizons for the use of furanocoumarins in the study of plant defence. For instance, by generating psoralen-producing tomatoes, it is now possible to evaluate the metabolic costs and defensive profits linked to psoralen production, which might lead us to better understand the trade-offs between growth and defence. Consequently, we used a multi-gene cloning technology called GoldenBraid to construct a plasmid harbouring the four genes of the psoralen biosynthesis pathway. Using transgenesis methods along with in vitro culture, we used this plasmid to initiate plant transformation, in order to generate psoralen-producing tomatoes. These transformations were not conclusive, but our study constitutes a pioneer work that will be continued. In particular, it allowed to the identification of some weaknesses in the initial strategy and the establishment of recommendations that will be essential to overcome these limits.
Au cours de l’évolution, les plantes ont développé de nombreux mécanismes de défense contre les stress biotiques, telles que la production de métabolites secondaires variés. Par exemple, certaines espèces comme le figuier (Ficus carica) produisent des molécules toxiques appelées furocoumarines. A l’heure où l’utilisation des pesticides est de plus en plus restreinte, comprendre les mécanismes naturels de défense des plantes devient de plus en plus important pour imaginer des méthodes de protection alternatives et repenser la gestion de nos cultures. Le premier objectif de ce projet consistait à poursuivre l’élucidation moléculaire de la voie de biosynthèse des furocoumarines ainsi qu’à mieux comprendre son évolution, à travers la caractérisation de nouveaux gènes de F. carica. Le second objectif consistait à évaluer le coût métabolique de la production de furocoumarines, en insérant la voie associée dans le génome de la tomate (Solanum lycopersicum), une plante qui, naturellement, ne produit pas ces molécules. Pour identifier de nouveaux gènes impliqués dans la synthèse de furocoumarines, nous avons combiné des approches de transcriptomique et de métabolomique : nous avons identifié des candidats dans une banque différentielle d’ARNseq de F. carica, avons cloné leurs séquences codantes, les avons exprimés dans un système hétérologue, et avons mené des tests d’activité enzymatiques. Nous avons ainsi identifié trois enzymes possédant des activités originales. Parmi elles, CYP76F112 joue un rôle clé dans la synthèse de furocoumarines, en convertissant la déméthylsubérosine en marmésine. Une analyse phylogénétique de gènes a été réalisée, suggérant fortement que CYP76F112 a évolué récemment dans un taxon restreint de Moracées, via une expansion de CYP76Fs. Des approches de modélisation et de mutagenèse dirigée ont également permis d’identifier quatre acides aminés impactant la spécificité et l’affinité de CYP76F112. Ces acides aminés semblent eux aussi avoir évolué récemment, et leur évolution a certainement été critique pour l’apparition de l’activité marmésine synthase. Ainsi, CYP76F112 améliore significativement notre compréhension de la production de furocoumarines dans le règne végétal, dans la mesure où son apparition récente supporte l’hypothèse selon laquelle les furocoumarines seraient apparues par évolution convergente dans des familles de plantes éloignées. De plus, CYP76F112 complète le jeu de quatre enzymes permettant la synthèse de psoralène (une furocoumarine toxique) à partir d’acide coumarique (un composé commun), ce qui ouvre de nouveaux horizons quant à l’utilisation des furocoumarines dans l’étude de la défense des plantes. Par exemple, en générant des tomates productrices de psoralène, il est désormais possible d’évaluer le coût métabolique et les bénéfices défensifs liés à la production de psoralène, ce qui pourrait conduire à une meilleure compréhension des compromis croissance-défense. En conséquence, nous avons utilisé la technique de clonage multigénique du GoldenBraid pour construire un plasmide portant les 4 gènes de la voie de biosynthèse du psoralène. En utilisant des techniques de transgenèse et de culture in vitro, nous avons utilisé ce plasmide pour initier des transformations de plantes, dont le but était de générer des tomates productrices de psoralène. Ces transformations n’ont pas été concluantes, mais notre étude constitue un travail pionnier qui sera poursuivi. En particulier, il a mené à l’identification de failles dans notre stratégie initiale, ainsi qu’à l’établissement de recommandations essentielles pour dépasser ces limites.
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Cite

Cloé Villard. How to produce your furanocoumarins : the hidden pathway ~ From the characterisation of new P450s to the evolution of the furanocoumarin pathway and the development of tools allowing the study of furanocoumarins’ metabolic cost. Vegetal Biology. Université de Lorraine, 2020. English. ⟨NNT : 2020LORR0201⟩. ⟨tel-03184585⟩
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