Characterization of the enzymatic activity and the role in ribosomes biogenesis of human nucleolar protein p120 and yeast homolog Nop2p
Etude des propriétés enzymatiques et du rôle dans la biogénèse des ribosomes de la protéine humaine p120, marqueur de l'évolution tumorale, et de Nop2p son homologue chez Saccharomyces cerevisiae
Résumé
The protein p120 is a proliferation marker that was originally identified in human tumor cells. The yeast homologue of p120, nucleolar protein Nop2p, was shown to be essential for viability of yeast. Alignment of Nop2p with human p120 points out the evolutionary conservation of a large domain that contains a SAM-binding motif and a protein domain having potential RNA: m5C-méthyltransférase activity. By in vitro methylation experiments and a sodium bisulfite approach, we show that Nop2p is a RNA: m5C-methyltransferase specific for 25S rRNA nucleotide 2870. In parallel, we succeeded to complement Nop2-deficient yeasts by human p120 and studied the importance of different sequence and structural domains of Nop2 and p120 for rRNA processing in vivo. In complementation assays, the C-terminal domain of Nop2 was essential for cell viability, whereas the absence of the N-terminal domain led to slow growth phenotype. Chimeric proteins formed by Nop2 and p120 fragments efficiently support growth if the N-terminal domain of Nop2 was present. In the absence of Nop2 or p120, the C1/C2 cleavages required to generate 5.8S and 25S rRNA were strongly reduced. The reduction of p120 content in human cells by specific siRNA leads to decreased 28S rRNA accumulation, supporting the idea on the implication of p120 in human pre-rRNA processing
La protéine p120, marqueur de prolifération, a été initialement identifiée dans les cellules humaines tumorales. Son homologue chez la levure, la protéine Nop2, est essentielle à la croissance et à la viabilité des cellules. La délétion du gène NOP2 bloque la maturation du pré-ARNr 27S en ARNr matures. Les protéines p120 et Nop2 possèdent des motifs de la famille des ARN : m5C-méthyltransférase. Dans un premier temps, j'ai démontré l'activité ARN : m5C-méthyltransférase de Nop2p par des expériences de méthylation in vitro en présence de S-adénosylméthionine tritiée. En parallèle, des expériences menées en collaboration avec une équipe allemande nous ont permis de localiser la méthylation catalysée par Nop2p à la position 2870 de l'ARNr 25S. Par la suite, j'ai étudié l'implication de Nop2p et de p120 dans la biogenèse de la sous-unité 60S du ribosome par plusieurs approches. Des expériences de complémentation dans une souche de levure [delta]NOP2 par la protéine humaine p120 et des protéines hybrides Nop2p-p120 ont permis de montrer que le domaine catalytique de p120, en présence du domaine N-terminal de Nop2p, permet une biogenèse normale des ribosomes chez S.cerevisiae. Parallèlement, des expériences d'ARN interférence dirigées contre p120 ont permis de montrer que, lorsque le taux de protéine p120 est diminué de 90% dans des cellules HEK293, la synthèse de l'ARNr mature 28S est ralentie. L'ensemble de ces données montrent que les protéines p120 et Nop2 appartiennent à la famille des protéines pré-ribosomiques essentielles au processus de maturation du pré-ARNr et semblent nécessaires à la structuration des pré-ARNr indispensable à leur maturation
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