Caractérisation enzymatique de la Glycéraldéhyde-3-Phosphate Déshydrogénase non phosphorylante de "Streptococcus mutans" - Université de Lorraine Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2001

Caractérisation enzymatique de la Glycéraldéhyde-3-Phosphate Déshydrogénase non phosphorylante de "Streptococcus mutans"

Résumé

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La Glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase non-phosphorylante (GAPN) de Streptococcus mutans est une enzyme de la famille des aldéhyde déshydrogénases non-phosphorylantes à cofacteur NAD(P) qui est impliquée au niveau du métabolisme cellulaire et des processus de détoxification. Le mécanisme catalytique de GAPN, qui est à deux étapes, a été déterminé : la fixation des substrats induit d'abord un réarrangement local du site actif. Cette transition conformationnelle augmente l'accessibilité et abaisse le pKa de la Cys302 essentielle de 8,5 à 6,2, le Glu268 passant d'un pKa vraisemblablement de 5,7 à à un pKa 7,6. Ces résultats ont été confirmés par la détermination de plusieurs structures tridimensionnelles par rayons X de GAPN. Les études cinétiques des étapes d'acylation et de désacylation pour l'enzyme de type sauvage et les mutants générés ont permis de montrer que 1) l'efficacité du transfert d'hydrure est assurée par la présence d'un site oxyanion composé notamment de la chaîne latérale de l'Asn169, 2) le résidu Glu268 joue un rôle essentiel uniquement au niveau de l'étape de désacylation en favorisant une orientation et une activation efficaces de la molécule d'eau. Enfin, la vitesse de désacylation, qui est très diminuée pour les mutants E268A et E268Q, est en partie restaurée en présence d'hydroxylamine ou l'hydrazine. Ces nucléophiles qui jouent le rôle d'accepteur d'acyle sont substrats à l'inverse du type sauvage. L'étude des sites de spécificité du substrat glycéraldéhyde-3-phosphate (G3P) et du cofacteur NADP a également été entreprise. La caractérisation enzymatique des mutants R124L, R301L et R459I, T195G et T195E a permis de montrer que 1) l'Arg124 n'est impliquée que dans la stabilisation du groupement phosphate en C3 du D-G3P, 2) l'Arg301 et l'Arg459 participent au positionnement, à l'orientation du substrat par rapport à la Cys302 et à la fixation du D-G3P, 3) la Thr195 joue le rôle de déterminant positif dans la fixation du cofacteur NADP.
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Dates et versions

tel-01746632 , version 1 (29-03-2018)

Identifiants

  • HAL Id : tel-01746632 , version 1

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Citer

Stéphane Marchal. Caractérisation enzymatique de la Glycéraldéhyde-3-Phosphate Déshydrogénase non phosphorylante de "Streptococcus mutans". Biochimie, Biologie Moléculaire. Université Henri Poincaré - Nancy 1, 2001. Français. ⟨NNT : 2001NAN10037⟩. ⟨tel-01746632⟩
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