Improvement of coagulation proteins biodisponibility by formation of soluble covalent conjugates and nanoparticles : application to protein C
Amélioration de la biodisponibilité de protéines de la coagulation par formation de conjugués covalents solubles et de nanoparticules : application à la protéine C
Résumé
A lot of biologically active molecules such as coagulation proteins i.e. factor VIII and protein C have a short half-life in blood. Their half-life i.e. their biodisponibility could be increased by means of either the formation of soluble covalent conjugates with a macromolecule or their encapsulation within stealth nanoparticles. Conjugate formation : A study was carried out on model proteins (hemoglobin and albumin) in low-concentration medium with derivatized dextrans but unfortunately, it couId not be applied to coagulation proteins (factor VlII, factor IX and protein C). However, the role of their carboxylate and amino groups could be underlined. Encapsulation : Biodegradable amphiphitic copolymers made of a poly(lactic acid) (PLA) hydrophobic block and of a monomethoxypolyethylene (MPEO) hydrophilic one were synthesized in order to prepare stealth biodegradable nanoparticles of protein C by a double emulsion method. Experimental conditions allowing the preservation of encapsulated protein C characteristics and the optimization of its encapsulation efficiency were determined for non stealth nanoparticles (PLA). The stealth character of blank MPEO-PLA nanoparticles were highlighted in vitro by studying complement consumption and phagocytosis. Afterwards, processing conditions allowing stealth nanoparticles of protein C with a satisfactory active protein C loading, a mean diameter of 200 nm and its progressive release were optimized. Finally, the in vivo behavior of such protein C nanoparticles was studied in guinea pig. Their stealth character and a progressive release of encapsulated protein C were brought to light.
De nombreuses biomolécules possèdent une faible durée de demi-vie, ce qui est le cas de certaines protéines de la coagulation telles que le facteur VII et la protéine C. Pour tenter de remédier à cet inconvénient, deux approches sont possibles : la formation d'un conjugué covalent macromoléculaire soluble et l'encapsulation dans des nanoparticules furtives. Formation de conjugués : Une étude de faisabilité a été réalisée sur deux protéines modèles (l'hémoglobine et l'albumine) en milieu dilué avec des dextranes fonctionnalisés. Il n'a cependant pas été possible de transposer de manière satisfaisante les résultats obtenus aux différentes protéines de la coagulation (facteur VIII, facteur IX et protéine C). Le rôle des fonctions carboxylates et amines de ces protéines a cependant pu être souligné. Encapsulation : Des copolymères amphiphiles biodégradables constitués d'un bloc hydrophobe d'acide poly(lactique) (PLA) et d'un bloc hydrophile de monométhoxypolyéthylène (MPOE) ont été synthétisés dans le but de préparer des nanoparticules biodégradables furtives de protéine C par la technique de la double émulsion. Les conditions expérimentales permettant de préserver les caractéristiques de la protéine C encapsulée et d'optimiser son rendement d'encapsulation ont été déterminées sur des nanoparticules non furtives (PLA). Le caractère furtif de ces nanoparticules de copolymère MPOE-PLA vierges a été mis en évidence in vitro par l'étude de la consommation du complément et de la phagocytose. Puis, les conditions opératoires permettant l'obtention de nanoparticules furtives de protéine C possédant une charge satisfaisante en protéine C active, un diamètre proche de 200 nm et sa libération progressive ont ensuite été optimisées. Enfin, l'approche du comportement d'une telle suspension de nanoparticules furtives de protéine C in vivo chez le cobaye a permis de clairement mettre en évidence leur caractère furtif ainsi que la libération progressive de la protéine C encapsulée.