Investigation of proteoglycan biosynthetic pathways and their alterations in joint diseases
Exploration des enzymes de biosynthèse des protéoglycanes et leurs altérations lors de pathologies articulaires
Résumé
Located at the cell-tissue-organ interface, heparan sulfate proteoglycans (HSPGs) facilitate ligand-receptor interactions crucial to many physiopathological processes. The synthesis of glycosaminoglycans (GAGs) requires the coordinated action of an array of glycosyltransferases (GTs) and sulfotransferases (STs). Although the biosynthetic scheme of HSPGs has been outlined, little is known about the regulation of this complex process. In the first part of our work, we performed structure-function studies of the human [Bêta]1,4-galactosyltransferase 7 ([Bêta]4GalT7) which catalyses a key step of the initiation of GAG synthesis and identified two conserved domains D163VD165 and 221FWGWGREDDE230 in the [Bêta]4GalT family. In vitro studies combined to ex vivo analysis of PG synthesis by 35S incorporation allowed us to determine the impact of site-directed mutations on the catalytic and functional properties of [Bêta]4GalT7. We identified key residues for donor UDP-galactose/Mn2+ and acceptor substrate binding, and catalysis. Secondarily, to investigate more in depth the mechanisms involved in the regulation of PG biosynthetic pathway, we inspected the 5' region of the genes coding for GT and ST enzymes and identified the presence of typical CpG islands with the most striking hypermethylation pattern for the 3-OST gene subfamily in the chondrosarcoma cell line H-EMC-SS (HEMC). Aberrant methylation was associated with downregulation of these genes and altered HS-GAG chains, as demonstrated both at biochemical and cellular levels. Treatment of cells with an inhibitor of DNA methyltransferases (5-aza-2'deoxycytidine) or reintroduction of 3-OST cDNA expression into HEMC cells resulted in a decrease in the proliferative and migration capacities of HEMC cells, and augmented adhesion ability of the cells. These findings underline the significance of HS alterations in the invasive phenotype of HEMC and identify 3-O-sulfation as a contributing factor to this process. We show for the first time that a specific set of HS-O-sulfotransferases is regulated via an epigenetic mechanism in HEMC cells, may be of particular relevance in understanding the process of cartilage tumor pathogenesis, towards the development of therapies targeting DNA methylation.
Dotés d'une position stratégique à la surface des cellules et au sein des matrices extracellulaires, les PGs à héparane-sulfates (HS) jouent un rôle essentiel dans de multiples processus physiopathologiques en régulant l'activité de nombreux médiateurs solubles. Les voies de biosynthèse des glycosaminoglycanes (GAGs) nécessitent l'action coordonnée de glycosyltransférases (GTs) et sulfotransférases (STs). Bien que celles-ci soient en partie caractérisées, leurs mécanismes de régulation restent mal connus. Dans la première partie de notre travail, nous avons réalisé une étude structure-fonction de la [Bêta]1,4-galactosyltransférase 7 ([Bêta]4GalT7) qui catalyse une étape clé de l'initiation des chaînes de GAG. Nous avons identifié deux motifs D163VD165 et 221FWGWGREDDE230 strictement conservés au sein des [Bêta]4GalTs. Une approche in vitro combinée à la mesure du taux de biosynthèse des PGs par incorporation de 35S ex vivo, a permis d'évaluer l'impact des mutations conservative et non conservative sur les propriétés cinétiques et fonctionnelles de la [Bêta]4GalT7. Nous avons ainsi pu cerner les résidus clés impliqués dans la reconnaissance des substrats donneur (UDP-galactose)/Mn2+, accepteur et la catalyse enzymatique. Dans un second temps, afin d'explorer les mécanismes de régulation des voies de biosynthèse, nous avons examiné les régions situées en 5' des gènes codant les GTs et STs et mis en évidence une méthylation aberrante touchant en particulier la famille des 3-OSTs, dans les cellules de chondrosarcome humain H-EMC-SS (HEMC). Cette hyperméthylation provoque une diminution d'expression de ces transcrits conduisant à une altération des chaînes de HS, restaurée par le traitement des cellules par un agent déméthylant, la 5-aza-2'déoxycytidine. Ce traitement ainsi que la surexpression des 3-OSTs par transfert de gène produit un ralentissement de la prolifération et motilité cellulaires et une augmentation de capacité d'adhésion des cellules. Ces résultats soulignent l'importance de l'altération des chaînes de HS cellulaires dans le caractère invasif des HEMC et suggèrent que la 3-O-sulfatation est un facteur contribuant à ce processus. Nous avons montré pour la première fois que les gènes codant les ST à HS sont régulés par un mécanisme épigénétique dans les cellules HEMC. Ces résultats ouvrent la voie à une meilleure compréhension des pathologies articulaires d'origine cancéreuse et permettent d'envisager des stratégies thérapeutiques ciblant la méthylation de l'ADN.
| Origine | Fichiers produits par l'(les) auteur(s) |
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