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Theses

Expression et caractérisation de la phosphate alcaline de l'Euryarchaeote Hyperthermophile Pyrococcus abyssi

Résumé : Les phosphatases alcalines (E.C. 3.1.3.1.) sont par définition des phosphomonoestérases aspécifiques, actives de façon optimale à pH alcalin. Décrites comme ubiquitaires, elles n'ont cependant jamais été étudiées chez les Archaea hyperthermophiles. La première étape de ces travaux a été l'isolement de la première phosphatage alcaline d'un tel organisme: Pyrococcus abyssi, Euryarchaeote issu d'une source hydrothermale, dont la température optimale de croissance est de 96°C. Le gène phoA, identifié sur génome de P. abyssi, a été cloné et la protéine recombinante exprimée chez Escherichia coli. Celle-ci a été purifiée, permettant de confirmer l'activité phosphatase alcaline codée par ce gène. La température et le pH permettant son activité optimale sont respectivement de 70°C et 11,0. L'enzyme a montré une grande thermostabilité, avec des demi-vies respectives à 100°C et 105°C de 18 heures et 5 heures. Une étude sur l'influence d'effecteurs métalliques a révélé sa nature de métallo-enzyme, caractéristique des phosphatases alcalines. Dans un second temps, ces travaux ont consisté à déterminer la structure quaternaire de la phosphatase alcaline de P. abyssi. Plusieurs tests ont permis d'identifier la forme homodimérique comme unique forme active. Cette structure quaternaire, deux sous-unités de 52 kDa chacune, s'est avérée dépendante du pH, de la composition du tampon et du contenu métallique de l'enzyme. Enfin, la troisième partie de cette thèse concerne l'étude de l'expression de la phosphatase alcaline recombinante de P. abyssi. Une étude a été réalisée en utilisant le système Escherichia coli et la régulation du promoteur T7, avec ou sans co-expression des ARNt relatifs aux codons rares. La protéine recombinante a également été exprimée dans la levure méthylotrophe Pichia pasto ris par sécrétion, dans un fermenteur d' 1,2 litres.
Document type :
Theses
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https://hal.univ-lorraine.fr/tel-01749731
Contributor : Thèses Ul <>
Submitted on : Thursday, March 29, 2018 - 12:25:11 PM
Last modification on : Thursday, January 31, 2019 - 1:27:51 AM
Document(s) archivé(s) le : Friday, September 14, 2018 - 8:53:32 AM

File

INPL_T_2002_ZAPPA_S.pdf
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  • HAL Id : tel-01749731, version 1

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Sébastien Zappa. Expression et caractérisation de la phosphate alcaline de l'Euryarchaeote Hyperthermophile Pyrococcus abyssi. Alimentation et Nutrition. Institut National Polytechnique de Lorraine, 2002. Français. ⟨NNT : 2002INPL081N⟩. ⟨tel-01749731⟩

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