Molecular Characterization of LncRNAs: ANRIL as a Model System
Dissection fonctionnelle des longs ARN non-codants : ANRIL comme modèle d'étude
Résumé
The increased knowledge on long non-coding RNA (lncRNA ≥ 200-nts lacking obvious coding regions) and their involvement in global genome regulation push the lncRNA-disease interconnection to a promising and timely field of research. Due to flexible 2D structures and multiple protein binding sites, lncRNAs carry intrinsic features conferring a wide regulatory potential. Although lncRNAs are being extensively studied, the field is still suffering from a lack of knowledge on their structure/function relationships at the molecular and cellular levels. The team focuses on the characterization of the lncRNA named ANRIL (Antisense Non-coding RNA in the INK4 Locus). ANRIL is an ideal study model since it is associated to human diseases and is likely implicated in regulating the fine-tuning of gene expression via the recruitment of nucleoprotein complexes. Until now, ANRIL functions have only been superficially explored at the molecular level. ANRIL belongs to the 9p21 locus that is silenced by ANRIL via the recruitment of the polycomb repressor complex PRC1 and PRC2. Even though the trans-regulatory activity of ANRIL was demonstrated by previous studies, its molecular aspect needed to be refined. For instance, the coding and the non-coding genes contacted and regulated by ANRIL in a direct manner remained unknown. Also not documented were the mechanisms engaged by ANRIL to associate specifically with the genome. Our work tends to refine the so-called trans-activity by identifying the genes directly contacted and regulated by ANRIL. We identified genome-wide the chromatin occupancy of ANRIL in HEK293 by applying the ChIRP-seq approach and found that ANRIL associates with 3227 binding sites mostly composed by G/A residues. By crossing the ChIRP-seq with transcriptomic data from ANRIL knocked-down cells, we established a list of 189 genes corresponding to the primary trans-targets of ANRIL since they were both contacted and affected by the presence of ANRIL. Among them, 123 genes were found to be negatively regulated by ANRIL. In silico approaches highlighted the presence of multiple classes of transposable elements throughout ANRIL exons. In particular, 70% of the longest Exon8 was made up of ERVL element. We investigated its putative role in ANRIL's trans-activity. We showed that it is at least partially responsible for the association of ANRIL to the chromatin since deletion of Exon8 resulted in a severe reduction of ANRIL's genomic occupancy. By applying highly stringent criteria, we accurately identified 9 out of the 123 trans-target genes of ANRIL which expression specifically depends on Exon8. By further in silico, in cellulo and in vitro characterization, we showed that Exon8 contains a 42-nts sequence contributing in the recognition and subsequently in the silencing of the FIRRE and TPD52L1 genes. We brought evidences in favor of a recognition mode involving DNA/DNA:RNA triplex formation. Furthermore, we initiated the identification of ANRIL’s protein partners. By in vitro and in cellulo approaches, we identified hnRNP K as a novel partner of ANRIL. We evidenced a potential coregulatory role of ANRIL and hnRNP K on the 9p21 locus and other distal inflammatory loci. Finally, using the Stanislas Cohort, the identification of RNA and DNA biomarkers for the early diagnosis of cardiovascular and metabolic diseases has been initiated. GWAS data revealed novel associations of 9p21 locus SNPs with cardiovascular and metabolic diseases. We think that the conjugation of cellular, molecular and biochemical approaches we deployed in the study allowed to generate a clearer vision of ANRIL activity and its molecular links to diseases.
Les techniques de séquençage haut-débit ont permis de révéler la complexité réelle du transcriptome, et ceci par l'identification de nouveaux ARN non-codants. Parmi eux, plus de 120000 longs ARN non-codants (lncRNA) ont été identifiés chez l'homme. Il s'agit d'ARN dépourvus de phase ouverte de lecture et dont la taille excède 200 nucléotides. Accomplissant une variété remarquable de fonctions biologiques, les lncRNA représentent dorénavant une nouvelle classe de régulateurs géniques. Néanmoins, les mécanismes d’action moléculaire de ces lncRNA restent encore largement énigmatiques. Ce projet se concentre sur les principes qui gouvernent l'activité d'un lncRNA appelé ANRIL identifié comme facteur de susceptibilité dans de nombreuses pathologies. Chez l'homme, le gène ANRIL est localisé dans le locus 9p21 qui contient également les gènes CDKN2A et CDKN2B. Ces derniers codent deux inhibiteurs de cyclines impliqués dans la régulation du cycle cellulaire. En liant le complexe PRC2 responsable de la déposition des marques H3K27me3, ANRIL facilite le recrutement de ce complexe au sein du locus 9p21 et par conséquent l'extinction transcriptionnelle des gènes CDKN2A et B. Cette activité d'ANRIL sur son propre locus est qualifiée d'activité -cis. De nombreuses données suggèrent qu'ANRIL est également capable de moduler l'expression de gènes localisés hors du locus 9p21. Cette activité est qualifiée de -trans. Notons que les études n'ont jusqu'alors jamais permis d'identifier à haute résolution ni de façon exhaustive ces régions génomiques. Elles n'ont jamais permis également de documenter les mécanismes mis en jeu par ANRIL pour lier de façon spécifique les loci dont il régule l'expression. Ce travail de thèse vise donc à raffiner l'activité trans d'ANRIL jusqu'ici décrite et ceci en identifiant les gènes contactés et modulés par ANRIL de façon directe. Par des expériences de ChIRP-seq, nous avons montré qu'au sein du génome de HEK293, ANRIL contacte 3227 régions principalement composées de résidus G et A. Le croisement de ces données avec des résultats d'analyse transcriptomique nous a permis de mettre en relation l'occupation génomique d'ANRIL avec les gènes dont l'expression dépend de sa présence. Nous avons pu identifier 189 gènes que nous avons qualifiés de cibles directes. Parmi ces cibles, 123 sont régulées négativement par ANRIL supposément via le recrutement du complexe PRC2. Par des approches in silico, nous avons montré qu'ANRIL contient des éléments répétés de types transposons. En particulier, l'exon 8 d'ANRIL est composé à hauteur de 70% par des éléments ERVL. Nous avons mis en évidence que ces éléments sont impliqués dans la liaison d'ANRIL à la chromatine. Nous montrons également que parmi les 123 cibles directes d'ANRIL, la régulation négative de 9 d'entre elles dépend de la présence de l'exon 8. Nos données suggèrent également que parmi ces 9 gènes, FIRRE et TPD52L1 sont contactés par une région de 42 nucléotides hébergée au sein de l'exon 8 et ceci par la formation vraisemblable de triplex ADN/ADN:ARN. Nous avons également initié l'identification des protéines liant ANRIL. Par des approches in vitro et in cellulo, nous avons identifié hnRNP K comme nouveau partenaire d'ANRIL. La caractérisation fonctionnelle d'hnRNP K suggère qu'elle serait impliquée dans les fonctions d'ANRIL sur le locus 9p21 mais également sur d'autres régions distales codant notamment des facteurs de la réaction inflammatoire. Nous avons aussi initié la recherche de nouveau biomarqueurs ADN et ARN pour certaines pathologies en utilisant la cohorte Stanislas. Les analyses préliminaires de GWAS ont permis de découvrir de nouveaux polymorphismes associés aux pathologies cardiovasculaires et métaboliques. En conclusion, nous pensons que les méthodes de biologie cellulaire, moléculaire et biochimique que nous avons combinées a permis d'apporter une vision plus claire du mode d'action d'ANRIL.