Intrinsic and extrinsic determinants of the aggregation process of amyloid proteins
Déterminants intrinsèques et extrinsèques du processus d'agrégation des protéines amyloïdes
Résumé
Amyloids are a group of peptides and proteins that fold into assemblies of insoluble fibrils of very regular and tightly packed β cross structures, which resemble a steric zipper. They are associated with many civilization diseases, such as type 2 diabetes, and wide range of neurodegenerative diseas-es. However, due to their self-assembly properties and unique physicochemical characteristics, as well as favorable mechanical and optical features, amyloids can and are being used in different fields of material and life sciences.
Amyloids are very sensitive to various experimental conditions in which their aggregation pro-cess is studied. Moreover, experimental conditions have a great influence on the amyloid characteris-tics and classification. In many cases, data collected from experiments using different techniques and performed by various scientific groups, do not include all the information about the specifics regard-ing experimental conditions. This has a strong impact on the ability, for instance of bioinformatics methods, to predict the amyloid propensity or the structural models of aggregation.
This dissertation focuses on the influence of selected internal and external factors affecting the aggregation process of amyloidogenic peptides. In the study, we consider in particular the length of the amino acid sequence, the effect of mutations, the influence of the solvent including, type and salt concentration, the interactions with other peptides, as well as the proximity and interaction with a cell wall (lipid environment). This examination concerned selected pathological and functional amy-loids and their most relevant fragments, and relied on results from experimental and computational investigations.
First, we set a reference protocol to study the aggregation properties of short peptides, neces-sary to identify possible amyloidogenic amino acid sequences. Hence, we selected hexapeptides using AmyloGram, a well-established bioinformatics prediction tool. Then we examined whether and to what extent, poorly annotated training data can influence the accuracy of bioinformatics methods. Finally, we investigated whether longer sequences can be treated in the same way as short ones.
Second, we examined experimentally long amino acid sequences (up to 23 amino acids) from the functional amyloid CsgA protein (consisting of R1-R5 imperfect fragments) in order to check their amyloid propensity. We investigated whether such peptides are more sensitive than pathological amyloids to selected internal and external factors, such as: point mutations, solvent, type of ions, ions’ concentration. To do so we compared the effects of these parameters on the aggregation proper-ties of homologous repeats from two bacteria Escherichia coli and Salmonella enterica. This study included the influence of mutations, which has been validated by computational and theoretical stud-ies.
We finally conducted a study on pathological amyloids (sequences up to 42 amino acids), namely Aβ42 and hIAPP. To mimic physiological conditions, experiments and simulations were car-ried out in the presence of a lipid membrane. Therefore, we investigated the influence of lipid mem-brane and interaction with another peptide on aggregation of these amyloids.
The results of the research present that it is important to collect coherent data from experi-ments, which could be disrupted by non-identical conditions. Additionally, different experimental methods may deliver somehow different results regarding the same peptides. This effect is more sig-nificant in case of some sequences.
We found that short hexapeptide sequences exhibit distinct aggregation propensities in re-sponse to external factors, e.g., the solvent used, compared to longer sequences (up to 23 amino acid). The flexibility of six-amino acid sequences allows them to adopt specific conformations. Moreover, the symmetry-breaking transitions phenomenon plays a crucial role in this process.
Additionally, we showed that the choice of solvent influences on the aggregation process. The usage of deuterium oxide might alter the classification, as observed for the R2 fragment of S. enter-ica. Fibrils were detected in the presence of heavy water but not in phosphate buffered saline. The dominant peptide conformation in D2O was attributed to intermolecular aggregates, a signature typi-cal of amyloid structures. Based on these findings, the R2 fragment's classification as amyloid or non-amyloid depends on the conditions applied.
Next, we showed that R4 fragment from S. enterica (SR4) has a larger tendency to aggregate compared to the R4 fragment from E. coli (ER4). Theoretical sequence analysis revealed that SR4 has higher hydrophobicity and electric charge values than ER4. Those factors are known to increase pro-tein aggregation. Additionally, SR4 has more significant variations in gatekeeper residues, which play a crucial role in regulating amyloid formation. The results indicate that specific amino acid substitu-tions can significantly affect the propensity of functional amyloid proteins to form amyloid struc-tures, with potential functional consequences.
The research highlighted the influence of the phosphate buffer ions on the peptides' morphol-ogy, affecting the local electrostatic interactions involving the polypeptide chains. The molecular dy-namics simulations revealed that the interactions of positively charged amino acids with negatively charged phosphate moieties in the buffer determined the morphology. Non-specific ion enrichment may occur in the proximity of protein moieties that bear charges opposite to those of the ions. Hence, the dimers structures observed in the simulation may have contributed to the snail-like conformation of the M4 peptide.
In the last phase of the study, the stability of Aβ42 in a lipid membrane was examined through molecular dynamics simulations and atomic force microscopy. The results suggested that Aβ42 remains embedded in the lipid membrane, indicating that peptide aggregation may occur within the membrane. It was also found that Aβ42 interacting with hIAPP exhibited a higher β-sheet con-tent when in close proximity, compared to the analysis of Aβ42 alone. Atomic force microscopy in-vestigations showed that supported lipid bilayers were more affected in the presence of both Aβ42 and hIAPP.
Overall, the study sheds light on the potential challenges arising from the ambiguity of exper-imental outcomes in the context of amyloid investigations. Our research has shown that even small changes in experimental conditions can alter the properties of amyloid peptides and proteins, which can be the cause of obtaining incorrect models and predictions of bioinformatics tools, based on in-compatible learning data. However, as shown in the study, minor deviations are not detrimental to these tools. Bioinformatics methods are fairly robust to incompatibilities in the data, but their perfor-mance can be disrupted if the influence of experimental conditions and seemingly insignificant dif-ferences in sequences of homological sequences are not taken into the consideration. The results de-scribed above, confirm that in the process of planning experimental research is important to choose proper conditions according to the studied object. Based on that choice, we can effectively modulate the peptide tendency to aggregate.
Les amyloïdes sont un groupe de peptides ou de protéines qui se replient en assemblages de fibrilles insolubles de structure β-croiséss très régulière et étroitement embriqués, ressemblant à une fermeture à glissière. Ils sont associés à de nombreuses maladies, telles que le diabète de type 2, ainsi qu'à un large éventail de maladies neurodégénératives. Cependant, en raison de leurs propriétés d'au-to-assemblage, de leurs caractéristiques physico-chimiques uniques, ainsi que de leurs caractéristiques mécaniques et optiques particulieres, les amyloïdes sont utilisés dans différents domaines des sciences des matériaux et sciences de la vie.
Les amyloïdes sont très sensibles aux différentes conditions expérimentales dans lesquelles leur processus d'agrégation est accompli. De plus, les conditions expérimentales ont une grande influ-ence sur les caractéristiques et la classification des amyloïdes. Dans de nombreux cas, les données collectées à partir d'expériences utilisant différentes techniques et réalisées par différents groupes re-cherche n'incluent pas toutes les informations sur les spécificités relatives aux conditions expéri-mentales. Cela a un fort impact sur la capacité, par exemple des méthodes de bioinformatique, à pré-dire la propension de l’amyloïde à s’agréger.
Cette thèse se concentre sur l'influence de certains facteurs internes et externes sélectionnés qui affectent le processus d'agrégation de peptides amyloïdogènes. Dans cette étude, nous avons par-ticulièrement considéré la longueur des sequences d'acides aminés, les'effets de mutations, l'influence du solvant, dont son type et la concentration saline, les interactions avec d'autres peptides, ainsi que la proximité et l'interaction avec une paroi cellulaire (environnement lipidique). Cette analyse a porté sur une sélection d’amyloïdes pathologiques et fonctionnels et sur leurs fragments les plus pertinents. Elle s'est appuyée sur des simulations numériques et résultats expérimentaux.
Tout d'abord, nous avons établi un protocole de référence pour étudier les propriétés d'agréga-tion de peptides courts, nécessaire pour identifier les séquences d'acides aminés amyloïdogènes possi-bles. Pour ce faire, nous avons sélectionné des hexapeptides à l'aide d'AmyloGram, un outil de pré-diction bioinformatique bien établi. Ensuite, nous avons examiné si et dans quelle mesure les données d'entraînement peu annotées peuvent influencer l'exactitude des méthodes de bioinformatique. Enfin, nous avons étudié si les séquences plus longues peuvent être traitées de la même manière que les séquences courtes.
Ensuite, nous avons examiné expérimentalement de longues séquences d'acides aminés (jusqu'à 23 acides aminés) de la protéine amyloïde fonctionnelle CsgA (composée de fragments R1-R5) afin de vérifier leur propension à former des amyloïdes. Nous avons étudié si de tels peptides sont plus sensibles que les amyloïdes pathologiques à une sélection de facteurs internes et externes. Les facteurs choisis sont les mutations ponctuelles, le solvant, le type d'ions et la concentration en ions. Pour ce faire, nous avons comparé les effets de ces paramètres sur les propriétés d'agrégation de sequences homologues de deux bactéries Escherichia coli et Salmonella enterica. Cette étude a inclus l'influence des mutations, qui a été validée par des études computationnelles et théoriques.
Enfin, nous avons mené une étude sur des amyloïdes pathologiques (séquences jusqu'à 42 acides aminés), à savoir Aβ42 et hIAPP. Pour imiter les conditions physiologiques, des expériences et des simulations ont été réalisées en présence d'une membrane lipidique. Nous avons donc étudié l'in-fluence de la membrane lipidique et de l'interaction avec un autre peptide sur l'agrégation de ces am-yloïdes.
Les résultats de la recherche montrent qu'il est important de collecter des données cohérentes à partir d'expériences, qui pourraient être perturbées par des conditions non identiques. De plus, diffé-rentes méthodes expérimentales peuvent fournir des résultats quelque peu différents pour les mêmes peptides. Cet effet est plus significatif dans le cas de certaines séquences.
Nous avons découvert que la propension à s’agréger des courtes séquences hexapeptidiques se distingue de celle des séquences plus longues (jusqu’à 23 acides aminés) en fonctions de facteurs ex-ternes comme le solvant utilize. La flexibilité des séquences de six acides aminés leur permet d'adopter des conformations spécifiques. De plus, le phénomène de transition de brisure de symétrie joue un rôle crucial dans ce processus.
De plus, nous avons montré que le choix du solvant influence le processus d'agrégation. L'uti-lisation d'oxyde de deuterium (D2O) peut modifier la classification, comme observé pour le fragment R2 de S. enterica. Des fibrilles ont été détectées en présence d'eau lourde mais pas en solution tampon phosphate. La conformation dominante du peptide en D2O a été attribuée à des agrégats intermolécu-laires, une signature typique des structures amyloïdes. Sur la base de ces résultats, la classification du fragment R2 comme amyloïde ou non-amyloïde dépend des conditions appliquées.
Ensuite, nous avons montré que le fragment R4 de S. enterica (SR4) a une tendance plus forte à l'agrégation par rapport au fragment R4 d'E. coli (ER4). L'analyse théorique de la séquence a révélé que SR4 avait des valeurs d'hydrophobicité et de charge électrique plus élevées que ER4. Ces facteurs sont connus pour augmenter l'agrégation des protéines. De plus, SR4 présente des variations plus importantes dans les résidus dit « gate Keeper », qui jouent un rôle crucial dans la régulation de la formation amyloïde. Les résultats indiquent que des substitutions d'acides aminés spécifiques peu-vent affecter significativement la propension des protéines amyloïdes fonctionnelles à former des structures amyloïdes, avec des conséquences fonctionnelles potentielles.
Nos investigations ont mis en évidence l'influence des ions tampons phosphate sur la morphol-ogie des peptides, en affectant les interactions électrostatiques locales impliquant les chaînes polypep-tidiques. Les simulations de dynamique moléculaire ont révélé que les interactions des acides aminés chargés positivement avec les groupes phosphate chargés négativement dans le tampon déterminent la morphologie des fibrilles. Une concentration d'ions non spécifiques peut se produire à proximité des parties protéiques portant des charges opposées à celles des ions. Ainsi, les structures dimères obser-vées dans la simulation ont peut-être contribué à la conformation en forme d'escargot du peptide M4.
Dans la dernière section de ce travail, la stabilité de Aβ42 dans une membrane lipidique a été examinée à travers des simulations de dynamique moléculaire et l’utilisation d’un microscope à force atomique. Les résultats suggèrent que Aβ42 reste intégré dans la membrane lipidique, indiquant que l'agrégation du peptide peut se produire dans la membrane. Il a également été constaté que Aβ42 in-teragissant avec hIAPP présente une teneur en feuillet β plus élevée lorsqu'ils sont en proximité étro-ite, par rapport à l'analyse de Aβ42 seul. Les observations sous microscope à force atomique ont montré que les bicouches lipidiques supportées étaient plus affectées en présence de Aβ42 et hIAPP.
Dans l'ensemble, l'étude met en lumière les défis découlant de la forte dépendance des résul-tats en fonction des conditions expérimentales des propriétés des amyloïdes. Dans l’ensemble, nous avons montré que les conditions expérimentales jouent un rôle prépondérant dans la détermination des propriétés des amyloïdes. Ne pas en tenir compte lors de l’utilisation d’outils de bioinformatique peut induire des erreurs dans les modèles et predictions. Toutefois, comme nous l’avons montré, les écarts mineurs ne sont pas préjudiciables. Les méthodes de bioinformatique sont assez robustes aux incompatibilités dans les données, mais leurs performances peuvent être perturbées si l'influence des conditions expérimentales et les différences apparemment insignifiantes dans les séquences de séquences homologues ne sont pas prises en considération. En conclusion, la planification du proces-sus de la recherche expérimentale, requiert de choisir les bonnes conditions en fonction de l'objet étudié. Sur la base de ce choix, nous pouvons moduler efficacement la tendance du peptide à s'agré-ger.
| Origine | Fichiers produits par l'(les) auteur(s) |
|---|