Caractérisation biochimique et fonctionnelle des glutarédoxines de classe I chez Populus trichocarpa - Université de Lorraine Access content directly
Master Thesis Year : 2011

Caractérisation biochimique et fonctionnelle des glutarédoxines de classe I chez Populus trichocarpa

Abstract

Glutaredoxins (Grxs) are small ubiquitous proteins implicated in numerous biological processes through their disulfide bonds reduction capacity, especially glutathione adducts, and to bind ironsulfur clusters. In higher plants, this multigenic family's members (30 to 40 genes) are distributed through 4 classes. The work done during this internship aimed at the biochemical characterization of GrxC1, C2, C3 and C4 (class I) from Populus trichocarpa to complete the data already obtained on the poplar GrxS12 and the GrxC5 of Arabidopsis thaliana, to attempt to elucidate the catalytic mechanism at stake as well as to understand the role of the 3rd cysteine present in the C-terminal region in PtGrxC1 and PtGrxC2. These proteins and their respective cysteinic mutants have been produced in recombinant form in the heterolog system Escherichia coli and then purified. The measurement of the free thiol groups and the mass spectrometry experiences habe revealed that these 4 proteins are produced oxydized and that, as for PtGrxS12 and AtGrxC5, the catalytic cysteine of PtGrxC3 and C4 is stably glutathionylated. The redox state analysis of the wild type isoforms suggest the implication of the C-ter cysteine of PtGrxC1 and C2 in a covalent dimer's formation, of which the properties should be explored further. The activities of the wild type isoforms have been assessed in vitro for 2 classical substrates for the Grxs, dehydroascorbate and hydroxyéthyldisulfide. The reduction capacity of insulin disulfide bonds has also been assessed. The results suggest that these 4 Grxs use a mechanism previously described as monothiol, as GrxS12 and GrxC5, which implicate only one cysteine over the 2 or 3 present. Finaly, the Western blot analysis of the Grxs abundance in several organs shows that PtGrxC4 is expressed in most of the analysed tissues, particularly in stems and fruits.
Les glutarédoxines (Grxs) sont de petites protéines ubiquitaires impliquées dans de nombreux processus biologiques à travers leur capacité à réduire des ponts disulfure, notamment des adduits glutathion et à lier des centres fer-soufre. Chez les plantes supérieures, les membres de cette famille multigénique (30 à 40 gènes) sont répartis en 4 classes. Les travaux réalisés au cours de ce stage visait à caractériser biochimiquement les GrxC1, C2, C3 et C4 (classe I) de Populus trichocarpa afin de compléter les données déjà obtenues sur GrxS12 de peuplier et GrxC5 d'Arabidopsis thaliana, de tenter d'élucider le mécanisme catalytique mis en jeu ainsi que le rôle de la 3ème cystéine présente en région C-terminale chez PtGrxC1 et PtGrxC2. Les protéines et leurs mutants cystéiniques respectifs ont été produits sous forme recombinante dans le système hétérologue Escherichia coli puis purifiés. La mesure des groupements thiols libres et les expériences de spectrométrie de masse ont révélé que ces 4 protéines sont produites sous forme oxydée et que, tout comme PtGrxS12 et AtGrxC5, la cystéine catalytique de PtGrxC3 et C4 est glutathionylée de manière stable. L'analyse de l'état redox des isoformes sauvages suggère l'implication de la cystéine en C-ter de PtGrxC1 et C2 dans la formation d'un dimère covalent dont les propriétés devront être étudiées plus avant. Les activités des isoformes sauvages ont été mesurées in vitro pour 2 substrats classiquement utilisés dans le cas des Grxs, le déhydroascorbate et l?hydroxyéthyldisulfide. La capacité de réduction des ponts disulfure de l'insuline a également été évaluée. Les résultats obtenus suggèrent que ces 4 Grxs utilisent un mécanisme dit monothiol, tout comme GrxS12 et C5, faisant intervenir une seule cystéine sur les 2 ou 3 cystéines présentes. Enfin, l'analyse par Western blot de l'abondance de ces Grxs dans plusieurs organes indique que PtGrxC4 est exprimée dans la plupart des tissus analysés, et de manière importante dans les tiges et les fruits.
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Dates and versions

hal-01796799 , version 1 (22-05-2018)

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  • HAL Id : hal-01796799 , version 1

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Cite

Bruno Dastillung. Caractérisation biochimique et fonctionnelle des glutarédoxines de classe I chez Populus trichocarpa. Sciences de l'environnement. 2011. ⟨hal-01796799⟩
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