Detection and visualisation of infectious human adenoviruses using a combined cell culture-molecular beacon assay
Mise en évidence du caractère infectieux des adénovirus par culture cellulaire couplée à une hybridation in situ
Abstract
Human adenoviruses, affiliated to the Adenoviridae family, are part of the most commonly detected viruses in contaminated surface waters and belong to the 12 priority microorganisms of the contaminant candidate list for drinking water (CCL3, USEPA). The aim of this study was to develop a rapid method for visualization of the infectious status of human adenoviruses by combining cell culture with fluorescent in situ hybridization using a molecular beacon oligonucleotide probe. Fluorescence is generated when the molecular beacon probes undergo a spontaneous conformational change upon formation of a hybrid with homologous mRNA during the viral replication cycle in the host cell. The fluorescent signal is then detectable by imaging methods such as confocal laser scanning microscopy. The experimental protocol (fixation and permeabilization of cells, staining of plasma membranes and nuclei, hybridization conditions) was developed with human adenovirus type 2 as viral model and the host cell line HEK 293A. Despite problems of reproducibility and the need for further optimization of the technique, promising results were obtained with detection of viral mRNA inside the cells in less than 24 hours after infection.
Les adénovirus humains, membres de la famille des Adenoviridae, font partie des virus les plus couramment identifiés dans les eaux de surface contaminées et ont été inclus dans la liste des 12 contaminants microbiens à surveiller dans les eaux de consommation (CCL 3, US EPA). L'objectif de ce travail était de développer une méthode rapide de visualisation du caractère infectieux par hybridation in situ de l'ARN messager viral avec une sonde oligonucléotidique fluorescente de type «molecular beacon». Suite à la réplication virale dans les cellules hôtes, les sondes forment des hybrides avec les ARN messager viraux. Cela induit un changement conformationnel spontané des sondes, qui dès lors fluorescent. Le signal peut ensuite être détecté en microscopie confocale à balayage laser. Le protocole expérimental (fixation et perméabilisation des cellules, marquages des composants cellulaires, condition d'hybridation...) a été élaboré à l'aide de l'adénovirus type 2 et de la lignée cellulaire HEK 293A. Malgré des problèmes de reproductibilité et la nécessité d'approfondir l'optimisation de cette technique, les résultats obtenus se sont révélés prometteurs car ils ont permis de détecter l'ARNm viral à l'intérieur des cellules en moins de 24 h après l'infection.
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