Recherche du déterminisme moléculaire d'un mutant PIG-PAP issu de l'instabilité génétique par complémentation fonctionnelle chez Streptomyces ambofaciens ATCC23877

Résumé : L'instabilité génétique observée chez Streptomyces ambofaciens affecte la pigmentation des colonies ainsi que d'autres caractères comme la sporulation ou la production d'antibiotiques. L'identification des gènes impliqués dans le phénotype dépigmenté s'est longtemps heurtée à l'impossibilité d'utiliser, pour le clonage, des mutants dépigmentés issus de l'instabilité génétique. En effet, la plupart de ces mutants présente des délétions de très grande taille (jusqu'à 25% du génome), associées dans certains cas à l'amplification de séquences d'ADN voisines. Récemment, des mutants dépigmentés issus d'événements mutatiormels survenus lors de la différenciation du mycélium aérien ont été caractérisés. Il s'agit des mutants Pig-pap. Ces mutants sont dépigmentés, asporulants et ne présentent pas de délétion de grande taille. De tels mutants pouvaient a priori être utilisés comme hôte de clonage pour l'identification de gènes cibles de l'instabilité génétique. La stratégie choisie a consisté à construire une banque d'ADN génomique d'une souche sauvage de S. ambofaciens chez E. coli et à introduire des plasmides recombinants chez un mutant Pig-pap par conjugaison intergénérique E. coli-S. ambofaciens afin de complémenter le phénotype mutant dépigmenté. Cette approche nécessitait dans un premier temps de disposer d'une souche de phénotype mutant suffisamment stable, capable de conjuguer. La souche WT8p25 a ainsi été choisie comme hôte de clonage. Une banque d'ADN génomique de S. ambofaciens chez E. coli a été réalisée en utilisant comme vecteur le plasmide conjugatif pSET152. 7400 clones ont été repiqués afin de recouvrir l'ensemble du génome de S. ambofaciens avec une probabilité de 0,997. De plus, la taille moyenne des inserts est de 8 kb. Une partie de cette banque a été criblée par conjugaison intergénérique E. coli-S. ambofaciens WT8p25. Ceci a permis l'isolement de la souche 29Cl présentant un phénotype pigmenté vert alors que celui de la souche sauvage est pigmenté gris. Aucune pigmentation de ce type n'avait été observée jusqu'à présent chez S. ambofaciens. La souche 29Cl a été caractérisée d'un point de vue phénotypique et moléculaire. Il a ainsi été observé que cette souche n'est pas restaurée dans la production de spores et est affectée dans son contenu lipidique intracellulaire global. De plus, elle synthétise un composé intracellulaire de nature inconnue et non observé dans la souche sauvage. Enfin, la souche 29Cl possède dans son génome un plasmide recombinant issu de la banque et présente, en plus, une délétion de grande taille associée à une amplification. Ainsi, ce travail va permettre d'une part d'identifier des gènes cibles de l'instabilité génétique par poursuite du criblage de la banque, et d'autre part d'aborder la relation entre la plasticité génomique et les changements métaboliques qui en résultent chez S. ambofaciens.
Document type :
Master thesis
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Contributor : Memoires Ul <>
Submitted on : Wednesday, October 17, 2018 - 12:21:14 PM
Last modification on : Friday, October 18, 2019 - 11:04:02 AM
Long-term archiving on : Friday, January 18, 2019 - 2:07:04 PM

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Sibel Catakli. Recherche du déterminisme moléculaire d'un mutant PIG-PAP issu de l'instabilité génétique par complémentation fonctionnelle chez Streptomyces ambofaciens ATCC23877. Microbiologie et Parasitologie. 2000. ⟨hal-01897542⟩

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