Study of human cardiac Troponin T pre-mRNA alternative splicing misregulation linked to myotonic dystrophies of type 1 and 2 and characteristics of the MBNL1 splicing factor involved in these pathologies
Étude des dérégulations de l'épissage alternatif du pré-ARN messager de la troponine T cardiaque humaine associées aux dystrophies myotoniques de types 1 et 2 et des caractéristiques du facteur d'épissage MBNL1 impliqué dans ces pathologies
Résumé
Amplifications of CTG motifs in the human DMPK gene are responsible for Myotonic Dystrophy of type 1. The resulting CUG repeats in pre-mRNAs capture the MBNL1 splicing factor, leading to mis-regulation of MBNL1 pre-mRNA targets. Due to the recent discovery of MBNL1 and its numerous isoforms (9) resulting from alternative splicing, little is known on how MBNL1 regulates splicing and how a decreased level of available MBNL1 generates splicing miss-regulations. First, we defined which of the MBNL1 alternative and constitutive exons are required for: i) RNA binding, ii) splicing activity and, iii) MBNL1 sub-cellular localization. Second, for a more precise definition of the MBNL1 RNA binding properties, we performed SELEX experiments using a library of RNA stem-loop structures containing a 18-nt long randomized sequence. Its leads to the identification of 12-nt long sequence adopting a peculiar stem-loop structure, whose importance for MBNL1 binding was revealed by its preservation by compensatory base-pair mutations. Finally, based on the above data, we studied the mechanisms involved in regulation of hcTNT exon 5 splicing. By in cellulo assays, we defined the hcTNT pre-mRNA region required for both normal inclusion and for the trans-dominant effect of CUG repeats. Within this region, we identified six new potential MBNL1 sites and demonstrated their functional role by in vitro and in cellulo assays. We also identified several additional splicing regulatory elements involved in normal and CUG-deregulated exon 5 inclusion and already showed a role of hnRNP H in splicing regulation. Altogether, our data bring new information important for understanding the pathology
Les amplifications de répétitions de triplets CTG dans le gène DMPK humain sont à l'origine de la dystrophie myotonique de type 1 ou DM1. Les répétitions CUG présentes dans les ARNm DMPK séquestrent le facteur d'épissage MBNL1 au sein de foci nucléaires et dérégulent l'épissage des pré-ARNm cibles de MBNL1. Par ailleurs, 9 isoformes de MBNL1, produites par épissage alternative, coexistent dans les cellules. Dans un premier temps nous avons recherché quels exons constitutifs ou alternatifs étaient requis pour la reconnaissance des ARN, la régulation de l'épissage et la localisation cellulaire de MBNL1. Nous avons ensuite entrepris de rechercher par l'approche SELEX les séquences de haute affinité pour MBNL1. Nous avons ainsi identifié une séquence conservée de 12 nucléotides de long, contenant un seul motif de fixation pour MBNL1 et adoptant une structuration tige-boucle particulière. L'importance de cette structuration a été confirmée par l'existence de mutants compensatoires au sein des ARN sélectionnés. Finalement nous avons étudié les mécanismes de régulation de l'inclusion de l'exon 5 du pré-ARNm de la troponine T cardiaque humaine (hcTNT). Une approche in cellulo nous a permis d'identifier les séquences minimales requises pour la régulation de l'épissage en conditions normales et en présence des répétitions CUG. Au sein de ces séquences nous avons identifié 6 nouveaux sites MBNL1 dont nous avons montré l'importance fonctionnelle in cellulo et in vitro. Nous avons également mis en évidence l'implication d'autres séquences régulatrices dans la régulation de l'inclusion de l'exon 5 du pré-ARNm hcTNT et un rôle de la protéine hnRNP H dans ces régulations. L'ensemble de ces données apportent de nouveaux éléments d'information importants pour la compréhension de la DM1
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