Role of folate binding protein in methotrexate resistance of human colon tumor cell line HT29
Implication de la protéine de liaison des folates dans la résistance au méthotrexate de la lignée d'adénocarcinome colique humain, HT29
Résumé
Aim : Methotrexate (MTX) is one of the major antifolates used as antimitotic. Sorne HT29 cells (human colon tumor cellline) are resistant to MTX. At concentration higher than 1O-4M, they are differentiated in enterocyt like cells, and show important amplification of dihydrofolate reductase (DHFR). This is not the only MTX resistance mechanism found in the literature. MTX transport was investigated by the study of membrane folate binding protein (M-FBP) and reduced folate carrier (RFC). Methods : HT29 cells adapted to increased
concentration in MTX were cultivated, with and without MTX, in media where folie acid concentration was between 0.9 nM à 9 IlM. We studied the transcription of M-FBPa, RFC, and DHFR genes by semi-quantitative
RT-PCR semi-quantitative. Binding activity of folie acid was measured in membrane preparations and after protein solubilisation by phosphatidylinositol-phospholipase C, as weIl as in the medium. The effect of the
medium on cell growth was analysed. Results: HT29 10-4M MTX cells transcripts respectively 3 and 2 times more M-FBPa than HT29 cells and HT29 10-4M MTX cells. With a lower folie acid concentration in the medium, M-FBPa gene transcription sill increases. DHFR gene transcription is 2.4 higher with HT29 10-4M MTX. RFC gene transcription is the same, whatever are the cells and the medium. Culture medium does not contain soluble folate binding protein (S-FBP). FBP binding activity is 2 to 8 times higher in HT29 10-4M MTX,
compared with other HT29 cells. Conclusion : Linked with DHFR amplification, M-FBPa overexpression contributes to MTX resistance of HT29 10-4M MTX cells.
But : Le méthotrexate (MTX) est un des principaux antifolates utilisé comme antimitotique. Certaines cellules HT29, adénocarcinome colique humain, sont résistantes au (MTX). A des concentrations en MTX>_ 10-4M, elles sont différenciées en cellules entérocytaires et présentent une amplification très importante de la dihydrofolate réductase (DHFR). Ce n'est pas le seul phénomène de résistance au MTX invoqué dans la littérature. Nous avons abordé le problème du transport du MTX par la protéine membranaire de liaison des folates (M-FBP) et par le transporteur des folates réduits (RFC). Méthodes : Les cellules HT29 adaptées à des concentrations croissantes en MTX ont été cultivées, en présence ou non de MTX, dans des milieux dont la concentration en acide folique varie de 0.9 nM à 9 mu. Nous avons étudié la transcription des gènes de la M-FBPa, du RFC et de la DHFR par RT-PCR semi-quantitative. L'activité de liaison de l'acide folique a été mesurée dans des préparations membranaires et après solubilisation de la protéine par action de la phosphatidylinositol-phospholipase C, ainsi que dans le milieu. L'effet du milieu sur la croissance cellulaire a été analysé. Résultats : Les cellules HT29 10-4M MTX transcrivent respectivement 3 et 2 fois plus de M-FBPa que les cellules HT29 et HT29 1O-7M MTX. Une baisse de la concentration en acide folique du milieu entraîne toujours une augmentation de la transcription du gène de la M-FBPa (1.3 à 2 fois). La transcription du gène de la DHFR augmente de 2.4 dans HT29 1O-4M MTX. La transcription du gène du RFC est égale quels que soient les cellules et le milieu. Le milieu de culture ne contient pas de S-FBP. L'activité de liaison de l'acide folique par la FBP est 2 à 8 fois supérieure dans les cellules HT29 lO-4M MTX, par rapport aux cellules HT29. Conclusion : Associée à l'amplification de la DHFR, la surexpression de la M-FBPa contribue à la résistance au MTX des cellules HT29 10-4M MTX.