Flow-induced VASP expression and phosphorylation in HUVECs
Modification de l'expression et de la phosphorylation de la VASP dans les cellules endothéliales soumises aux écoulements
Résumé
Vasodilator stimulated phosphoprotein (VASP) is a member of Ena/VASP protein family that links to the regulation of actin filaments and to signal transduction during cell morphological modification and migration. VASP tightly associates with microfilament, in particular at focal adhesions and celllamellipodia. ln this study, we examined the expression, phosphorylation and redistribution of VASP in HUVECs under flow conditions. And the mechanism of VASP phosphorylation was further studied with the enzyme inhibitors. We found by double immunofluoreseent staining that after exposure to a shear of 1,0 Pa for 24h, spots of VASP
were concentrated at the two extremities ofthick stress fibres. RT-PCR results indicated that the shear could induce VASP mRNA increase. Western blotting results showed that there was only non-phosphorylated VASP in static cells.
The VASP phosphorylation appeared as a transient phenomenon with peak values after Ih and 4h exposures to the
same shear stress. The shear stress of 1,5 Pa had similar tendencyas that of 1,0 Pa while the shear stress of 0,2 Pa showed a lower effect. Additionally, inhibition of the actin polymerization by cytoehalasin D blocked VASP expression and phosphorylation. H89, à PKA inhibitor, inhibited shear-induced increase of VASP expression and phosphorylation, while L-NNA, an NOS inhibitor showed adverse effects.These results show that shear stress induces the phosphorylation of VASP in endothelial cells, and this phosphorylation depends on the actin integrity and via a cAMP/PKA pathway.
La phosphoprotéine vasodilatatrice stimulée (VASP) appartient à la famille des protéines ENA/VASP qui est impliquée dans les modifications du cytosquelette et la transduction du signal lors de changements morphologiques et de migration cellulaire. La VASP s'associe avec les microfilaments d'actine, particulièrement aux points focaux d'adhésion, et aux lamellipodes. Dans cette étude, nous avons étudié l'influence des contraintes de cisaillement sur l'expression, la phosphorylation et la distribution des VASP dans les cellules endothéliales (HUVECs). Par ailleurs, nous avons également exploré deux voies de signalisation possibles pour expliquer la voie de régulation des VASP. Après stimulation par la contrainte de cisaillement, un double marquage immunofluorescence a été utilisé pour démontrer la relation entre l'organisation des fibres d'actine et la distribution des VASP. On observe que dans les HUVECs, après une contrainte de 1,0 Pa pendent 24h, les VASP sont concentrés aux extrémités des fibres de stress.
Les résultats de RT-PCR montrent une augmentation significative de la taille du fragment de 482 bp après une exposition d'une heure. La technique de western blotting a été utilisée pour déterminer le taux de l'expression et la phosphorylation de la VASP. En condition statique, les cellules contiennent uniquement des VASP déphosphorylées. Les cellules soumises à une contrainte de 1,0 Pa pour une durée d'une heure présentent le pourcentage de VASP phosphorylées le plus élevé. La contrainte de 1,5 Pa conduit à un taux plus faible dephosphorylation que celle de 1,0 Pa, et la contrainte de 0,2 Pa provoque une augmentation en retard. De plus, cette phosphorylation montre un caractère transitoire et parait réversible. Par ailleurs, la cytochalasine D (inhibiteur des fibres d'actine) et H89 (un inhibiteur de la PKA) empêchent l'augmentation des VASP provoquée par le cisaillement ([tau] = 1,0 Pa, 1h), tandis que la L-NNA (un inhibiteur de la NOS) présente un effet inverse. Ces résultats suggèrent que la contrainte de cisaillement provoque la phosphorylation des VASP dans la CE, mais cette phosphorylation dépend l'intégrité du cytosquelette et le taux de l'AMPc intracellulaire.