Effects of the PPAR[gamma] ligands on estrogens signaling pathway in breast cancer cells
Effets des ligands de PPAR[gamma] sur la voie de signalisation des oestrogènes dans les cellules cancéreuses mammaires
Résumé
Estrogen receptor alpha (ER[alpha]) is a major target in breast cancer treatment. About 70% of breast cancers are estrogen-sensitive meaning that estrogens stimulate their growth. Ligands of PPAR[gamma] (Peroxisome Proliferator Activated Receptor gamma) inhibit breast cancer cell proliferation both in vivo and in vitro. The aim of this work was to determine whether PPAR[gamma] ligands could interfere with estrogen signalling pathway. The effects of Rosiglitazone (RGZ), Ciglitazone (CGZ), Troglitazone (TGZ) and the natural PPAR[gamma] agonist 15d-PGJ2 were investigated in two hormone-dependent breast cancer cell lines, MCF-7 and ZR-75-1. In both of them, TGZ, CGZ and 15d-PGJ2 induced an inhibition of ER[alpha] signalling associated with the proteasomal degradation of ER[alpha]. ZR-75-1 cells were more sensitive than MCF-7 to these compounds. Treatments that induced ER[alpha] degradation also inhibited cell proliferation after 24h. In contrast, 24h exposure to RGZ, the most potent activator of PPAR[gamma] disrupted neither ER[alpha] signalling nor cell proliferation. 9-cis retinoic acid never potentiated the proteasomal degradation of ER[alpha]. PPAR[gamma] antagonists did not block the proteolysis of ER[alpha] in MCF-7 and ZR-75-1 cells treated with TGZ. ER[alpha] proteolysis still occurred in case of PPAR[gamma] silencing as well as in case of treatment with the PPAR[gamma]-inactive compound [delta]2-TGZ, demonstrating a PPAR[gamma]-independent mechanism. A previous study indicated that 15d-PGJ2 was able to covalently modify ER[alpha], but did not bind to ERß. First, we observed that in contrast to ER[alpha], ERß proteolysis did not occur in MCF-7 cells exposed to 15d-PGJ2. A differential proteolysis was also observed in case of exposure to thiazolidinediones. Moreover, transfection experiments using pEREtkLuc showed that ERa functionality was affected early after exposure of MCF-7 cells to thiazolidinediones. In order to determine if a covalent binding of PPAR[gamma] ligands to ER[alpha] could lead to its proteolysis, a biotinylated derivative of [delta] 2-TGZ was synthesized. However, pull-down assays performed using neutravidin beads did not allow to demonstrate a covalent interaction between ERa and biotinylated [delta] 2-TGZ. When we verified the efficiency of biotinylated [delta]2-TGZ on ER[alpha] proteolysis induction, we observed that the substitution by biotine potentiated the TGZ-induced proteasomal degradation not only of ER[alpha] but also of cyclin D1. In conclusion, the design of new thiazolidinedione derivatives could lead to more efficient molecules able to affect differentially ER in a PPAR[gamma]-independent way and could be an interesting tool for breast cancer therapy.
Le récepteur alpha des oestrogènes (ER[alpha]) est une cible privilégiée dans le traitement du cancer du sein. En effet, 70% des tumeurs sont hormono-dépendantes, c'est-à-dire qu'elles expriment ER[alpha] et que les oestrogènes contrôlent leur prolifération. Par ailleurs, les agonistes du récepteur nucléaire « Peroxisome Proliferator Activated Receptor gamma » (PPAR[gamma]) inhibent la prolifération des cellules cancéreuses mammaires in vivo et in vitro. L'objectif de la thèse visait à déterminer si ces composés, en particulier ceux de la famille des thiazolidinediones, interféraient avec la voie de signalisation des oestrogènes. Les travaux ont porté sur 2 lignées cancéreuses mammaires hormono-dépendantes : MCF-7 et ZR-75-1. La troglitazone (TGZ), la ciglitazone et la 15déoxy-Prostaglandine J2 (15d-PGJ2) altèrent la signalisation oestrogénique en induisant la dégradation de l'ER[alpha].Cette protéolyse fait appel au protéasome 26S et elle est plus accentuée pour la lignée ZR-75-1. Les composés qui altèrent la signalisation oestrogénique inhibent aussi fortement la prolifération cellulaire. La dégradation de ER[alpha] ne semble pas dépendre de l'activation des ligands de PPAR[gamma] puisqu'un agoniste puissant comme la rosiglitazone n'induit pas cet effet. L'utilisation d'antagonistes de PPAR[gamma], de la [delta]2-TGZ, dérivé de la troglitazone qui n'active pas PPAR[gamma] ainsi qu'une approche par interférence ARN ont permis de démontrer que la protéolyse de l'ER[alpha] est bien liée à mécanisme indépendant de PPAR[gamma]. La littérature indiquait que la 15d-PGJ2 se liait de façon covalente à ER[alpha], mais pas à l'isoforme ERß. Nous avons observé que la 15d-PGJ2 n'induisait pas la protéolyse de ERß. Une dégradation différentielle a aussi été observée avec les thiazolidinediones. En outre, l'activité transcriptionnelle de ER[alpha] est affectée précocement après l'exposition des cellules aux différents ligands, suggérant une modification du récepteur. Afin de savoir si une liaison covalente pouvait être à l'origine de la protéolyse, un groupement biotine a été greffé sur la [delta]2-TGZ afin de réaliser des expériences de pull-down. Ce composé n'a pas permis de démontrer l'hypothèse mais cette molécule induit plus efficacement que la molécule d'origine la protéolyse non seulement de l'ER[alpha], mais aussi de la cycline D1. Des modifications des ligands de PPAR[gamma] pourraient donc avantageusement diminuer les doses efficaces. Ces mécanismes PPAR[gamma]-indépendants, qui aboutissent à la dégradation de la cycline D1 et de ER[alpha] mais pas de ERß pourraient être intéressants dans l'optique d'une application à la thérapeutique des cancers mammaires.
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