La cholestérol oxydase (CO) est l'enzyme qui intervient dans la première étape du catabolisme microbien des stérols, en particulier du cholestérol. Les applications actuelles et potentielles de cette enzyme, dans les domaines pharmaceutique et agro-alimentaire, sont nombreuses, Dans ce contexte, l'optimisation de la production de la cholestérol oxydase chez Rhodococcus sp. GKI et surtout la compréhension des mécanismes qui régissent sa synthèse et sa sécrétion ont fait l'objet de ce travail. La souche utilisée est capable de croître sur le cholestérol comme unique source de carbone et de produire des dérivés dont la 4-cholestène-6-01-3-one. La présence de ce métabolite indique que la cholestérol oxydase est une enzyme trifonctionnelle avec des activités oxydasique, isomérasique et hydroxylasique. Les résultats obtenus mettent en évidence que la synthèse de CO est soumise à une répression par un ou plusieurs métabolites de dégradation du cholestérol et que son induction est liée aussi bien au catabolisme de la chaîne latérale qu'a la dégradation du noyau tétracyclique des stéroïdes. En fonction de la source de carbone, Rhodococcus sp. GKI produit la cholestérol oxydase sous deux formes : une membranaire et une sécrétée. La modulation de cette sécrétion est corrélée à la variation de la fluidité membranaire. Des techniques de purification de la cholestérol oxydase sont développées. Parmi ces procédés, l'extraction liquide-liquide est la mieux adaptée et la moins contraignante. L'automatisation du dosage du cholestérol permet de réduire le temps d'analyse et de rendre les résultats plus fiables. Dans ce contexte, une électrode à cholestérol oxydase est conçue. Les résultats obtenus indiquent que le système est fonctionnel.