Implication de la cytométrie en flux quantitative et de la microscopie à sectionnement optique 3D à fluorescence dans l'exploration des récepteurs d'adhérence leucocytaires : applications à différents domaines pathologiques - Archive ouverte HAL Access content directly
Theses Year : 2002

Implication de la cytométrie en flux quantitative et de la microscopie à sectionnement optique 3D à fluorescence dans l'exploration des récepteurs d'adhérence leucocytaires : applications à différents domaines pathologiques

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Abstract

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Les récepteurs d'adhérence constituent les acteurs essentiels de l'interaction leucocyte-cellule endothéliale. Leur fonctionnalité implique des variations quantitatives du niveau de leur expression ainsi que des redistributions spatiales. Ce travail a eu pour but d'explorer le comportement de ces récepteurs pour des leucocytes de sujets sains et pathologiques à l'aide d'une double approche méthodologique. Dans la première partie méthodologique, nous avons mis au point un protocole standardisé de mesure, par cytométrie en flux quantitative, çle l'expression des [bêta]2 intégrines CD11 a,b,c/CD18 et de la L-sélectine, à la surface des polynucléaires neutrophiles. Ceci nous a permis d'appréhender l'importance de l'influence des paramètres pré-analytiques sur cette mesure et d'établir les valeurs de références pour des témoins. L'utilisation de la microscopie à sectionnement optique à fluorescence 3D nous a permis de connaître la distribution spatiale de ces récepteurs, avec une distribution hétérogène à l'état basal et un regroupement en "clusters" après stimulation par le TNF[alpha]. Dans une deuxième partie, nous avons utilisé la cytométrie en flux quantitative, pour explorer ces récepteurs d'adhérence leucocytaires dans différents domaines pathologiques impliquant, soit un défaut d'expression, soit un état d'activation leucocytaire (surexpression de l'expression [bêta]2 intégrines associée à une diminution de la L-sélectine). Nous avons ainsi trouvé un déficit, portant à la fois sur l'expression de [bêta]2 intégrines CD11 b/CD18 et sur la sélectine CD62L, et régressif sous G-CSF, chez un patient atteint de glycogénose lb. Ce résultat, rapporté à notre connaissance pour la première fois, contribue à expliquer, en association avec les autres anomalies fonctionnelles leucocytaires, la survenue des complications infectieuses ainsi que l'efficacité dè la thérapie par facteurs de croissances. Ensuite, notre étude sur les monocytes de patients atteints de cirrhose alcoolique nous a permis de mettre en évidence un phénotype d'activation pour les monocytes circulants avec une diminution du ratio d'activation pour CD11 b/CD18. Ces données illustrent que la pathogenèse de cette maladie est probablement liée à un processus inflammatoire en réponse à l'alcool et/ou à ses métabolites. La diminution du potentiel réactif des monocytes contribue à expliquer la susceptibilité de ces patients à présenter des complications infectieuses. La quantification de l'expression des récepteurs d'adhérence à la surface de polynucléaires neutrophiles incubés en présence d'hémoglobines modifiées a montré que ces nouveaux transporteurs d'oxygène n'entraînaient pas, in vitro, d'activation leucocytaire. Cette étude nous a donc permis de montrer que cette méthodologie était tout a fait adaptée à l'exploration du phénotype leucocytaire, en terme de marqueur d'activation. Enfin, nous avons élaboré, en collaboration avec une société commerciale, une trousse de quantification de l'expression de CD11 b afin de standardiser au maximum sa mesure et de pouvoir réaliser des comparaisons inter-laboratoires et/ou longitudinales. Son application dans le domaine de la pathologie infectieuse a permis de valider son utilisation en terme de sensibilité, spécificité et facilité d'utilisation. L'ensemble de ces études nous a permis de connaître les intérêts et limites de la quantification antigénique à l'aide d'un calibrant standardisé et d'envisager élargir son application pour d'autres types cellulaires et d'autres domaines d'applications.
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Cite

Véronique Latger-Cannard. Implication de la cytométrie en flux quantitative et de la microscopie à sectionnement optique 3D à fluorescence dans l'exploration des récepteurs d'adhérence leucocytaires : applications à différents domaines pathologiques. Biotechnologies. Université Henri Poincaré - Nancy 1, 2002. Français. ⟨NNT : 2002NAN10300⟩. ⟨tel-01754361⟩
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