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Theses Year : 2020

Congenital Disorders of Glycosylation and TMEM165 : A new player in proteoglycan synthesis

Troubles congénitaux de la glycosylation et TMEM165 : un nouvel acteur dans la biosynthèse des protéoglycanes

Abstract

Congenital Disorders of Glycosylation (CDG) is a group of human genetic disorders with defects in biosynthesis (glycosylation) of glycoproteins. Recent studies have discovered TMEM 165 as a novel protein deficient in CDG patients presenting bone abnormalities, suggesting a role of TMEM 165 in chondrogenesis and skeletal development. Proteoglycans (PGs) play a key role in several biological processes including chondrocytes maturation, growth plate development and intracellular signaling. Alterations in the synthesis of PGs may contribute to skeletal defects observed in TMEM 165-deficient CDG patients. To determine the link, if any, between TMEM165 deficiency and the synthesis of PGs, and to study the molecular mechanisms involved, we generated TMEM165 knock-out pre-chondrogenic ATDC5 cells using CRISPR/Cas9 technique. Interestingly, we showed that the knockdown of TMEM165 in ATDC5 cells resulted in profound defects in the synthesis of PGs and mainly impaired polymerization of both heparin-sulfate and chondroitin-sulfate glycosaminoglycan chains. Furthermore, we found that these defects can be overcome by supplying the cells with Mn2+. Similar results were observed in fibroblast cells from TMEM165-deficient CDG patient. These data suggest that TMEM165 is involved in the regulation of the homeostasis of Mn2+ which is used as a co-factor of Golgi glycosyltransferases and required for full enzyme activity. On the other hand, PGs play a key role in the regulation of TGFβ and BMP signaling. Given that these pathways regulate chondrogenesis and skeletal development their integrity was evaluated in TMEM 165-deficient ATDC5 cells and fibroblast from CDG patients. We demonstrated that TMEM165-deficiency functionally impairs TGFβ and BMP signaling pathways in both ATDC5 cells and human fibroblasts, suggesting a role in skeletal abnormalities observed in TMEM165-deficeint CDG patients. In addition, in vitro differentiation study of ATDC5 cells revealed that loss of TMEM165 expression promotes differentiation of ATDC5 cells towards hypertrophy, a process which may lead to premature chondrocyte maturation and to dwarfism observed in TMEM165-deficient CDG patients.
Les troubles congénitaux de la glycosylation (CDG) sont un groupe de troubles génétiques lié aux anomalies de glycosylation des glycoprotéines. Des études récentes ont identifié TMEM165 comme étant une nouvelle protéine déficiente chez les patients CDG présentant des anomalies ostéoarticulaires importantes, suggérant un rôle de TMEM165 dans la chondrogénèse et le développement squelettique. D’autre part, les protéoglycanes (PGs) jouent un rôle clé dans plusieurs processus biologiques, notamment la maturation chondrocytaire, le développement de la plaque de croissance et la signalisation cellulaire. Afin de déterminer s’il existe un lien potentiel entre le déficit en TMEM165 et la synthèse des PGs et identifier les mécanismes moléculaires impliqués, nous avons invalidé le gène TMEM165 dans les cellules pré-chondrocytaires ATDC5 en utilisant la technique CRISPR/Cas9. De façon intéressante, nous avons montré que l’invalidation du gène TMEM165 entraîne des anomalies de synthèse des PGs et principalement un déficit de polymérisation des chaînes de glycosaminoglycanes de type héparine-sulfate et chondroïtine-sulfate. De plus, nous avons montré que ces anomalies de synthèse peuvent être palliées par la supplémentation des cellules en ions Mn2+. Des résultats similaires ont été obtenus dans les fibroblastes de patient déficient en TMEM165. Ceci suggère que TMEM165 est impliqué dans la régulation de l'homéostasie du Mn2+, co-facteur requis pour une activité optimale des glycosyltransférases dans le Golgi. D’autre part, les PGs jouent un rôle clé dans la régulation de la signalisation du TGFβ et de la BMP. Étant donné que ces voies régulent la chondrogénèse et le développement squelettique, leur intégrité a été évaluée dans les cellules ATDC5 déficientes en TMEM 165 et les fibroblastes de patients CDG. Les résultats obtenus ont permis de montrer que la déficience en TMEM165 perturbe le fonctionnement des voies de signalisation du TGFβ et de la BMP dans les cellules ATDC5 et les fibroblastes humains mutés, suggérant un rôle dans les anomalies squelettiques observées chez les patients CDG déficients en TMEM165. De plus, l’étude de la différenciation in vitro des cellules ATDC5 a permis de révéler que la déficience en TMEM165 accélère la différenciation des cellules ATDC5 vers l’hypertrophie, un processus qui peut conduire à la maturation précoce des chondrocytes et au nanisme observé chez les patients CDG déficients en TMEM165.
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Sajida Khan. Congenital Disorders of Glycosylation and TMEM165 : A new player in proteoglycan synthesis. Biochemistry, Molecular Biology. Université de Lorraine, 2020. English. ⟨NNT : 2020LORR0155⟩. ⟨tel-03132575⟩
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