Study of the effect of the oxidative stress on spliceosomal activity and the C/D and H/ACA RNPs
Étude de l'effet d'un stress oxydant sur l'activité spliceosomale et sur les RNP à boîtes C/D et H/ACA
Résumé
During pre-RNA maturation process, alternative splicing (AS) selectively includes or excludes specific intronic or exonic sequences. This process leads from a given pre-RNA, to different isoforms. Some recent studies estimate that 95% of human genes are alternatively spliced. Then, it is not surprising that stress-induced modifications of splicing profils participate to the establishment of the cell response to stress or to the development of pathologies. Our global transcriptomic analysis has revealed significant splicing variations in response to an oxidative stress (500μM H2O2). That is why we were interested in such stress effects on the spliceosome, responsible for the dynamic catalysis of splicing. The functional spliceosome is composed by different ribonucleoproteins (RNPs), each being composed of a Uridine-rich small nuclear RNA (U snRNA) associated with specific proteins to form the mature UsnRNPs. To be functional, each UsnRNP should be maturated following different steps including the chemical modification of its RNA component. These post-transcriptional modifications are induced by another type of RNPs which are particularly enriched within nuclear Cajal bodies and are named scaRNPs (for small Cajal Bodies RNPs). Our results obtained by fluorescence microscopy techniques show that oxidative stress changes Cajal bodies structure by inducing the nucleoplasmic redistribution of its main structural and functional component, the coilin protein. Interestingly, we highlighted that coilin redistribution is accompanied with changes of the localization of others Cajal Body components: (i) factors involved in the formation of post-transcriptional modifications in UsnRNAs, (ii) factors involved in scaRNPs retention, (iii) UsnRNPs components. Oxidative stress also seems to induce the exclusion of SMN protein from the nucleus, knowing that it plays a central role in UsnRNP nuclear re-import during their maturation. This study has generated a large amount of fluorescence microscopy data, so that I have developed different bio-image analysis protocols in order to optimize the extraction and the processing of these data. In parallel, RNA-Immunoprecipitation (RIP) experiments coupled with high-throughput sequencing have revealed (i) a significant increase of U4, U5 and U6 snRNP fraction suggesting a potential effect of oxidative stress on the U4/U6-U5 tri-snRNP, (ii) oxidative stress-induced variations of the 2’-O-methylation level directly in mature U snRNPs.
Au cours du processus de maturation des pré-ARN, l’épissage alternatif (EA) inclut ou exclut sélectivement des séquences introniques et exoniques spécifiques, aboutissant à partir du même pré-ARN à différentes isoformes. Des études récentes étendues à l’ensemble du génome estiment que 95% des gènes humains sont épissés de façon alternative. Aussi, il n’est pas surprenant que des stress cellulaires induisent des changements du profil global d’épissage. Notre analyse globale de transcriptomique a révélé des variations d’épissages significatives en réponse à un stress oxydant. Nous nous sommes intéressés aux effets de ce stress sur le spliceosome, responsable de la catalyse dynamique de l’épissage. Le spliceosome fonctionnel est composé de différentes ribonucléoprotéines (RNPs), caractérisées par de petits ARN nucléaires riches en Uridine (U snRNA), chacun associé à des protéines spécifiques et formant ainsi les UsnRNPs. Pour être fonctionnelle, chaque U snRNP est maturée suivant différentes étapes comprenant la modification chimique de leur composant ARN. Ces modifications sont induites par d’autres RNPs qui sont particulièrement concentrées dans les corps de Cajal et sont ainsi appelés scaRNPs (small Cajal Bodies RNPs). Nos résultats obtenus par des techniques de microscopie de fluorescence montrent que le stress oxydant modifie la structure des corps de Cajal en induisant la redistribution nucléoplasmique de son composant structural et fonctionnel majeur, la protéine coiline. De façon intéressante, nous avons pu mettre en évidence que cette redistribution s’accompagne d’un changement de la localisation d’autres composants des corps de Cajal impliqués dans : (i) la formation de modifications post-transcriptionelles au sein des U snARNs, (ii) le recrutement des scaRNPs et (iii) la composition des UsnRNPs. Cette étude a généré un grand nombre de données en microscopie de fluorescence, ce qui m’a conduit à développer différents protocoles d’analyses d’images biologiques afin d’optimiser l’extraction et le traitement de ces données. En parallèle, des expériences d’immunoprécipitation de l’ARN (RIP) couplées à du séquençage haut débit ont révélé (i) une augmentation significative de la fraction des UsnRNP U4, U5 et U6 suggérant un éventuel effet du stress oxydant sur la tri-snRNP U4-U6.U5, (ii) des variations du taux de 2’-Ométhylation induites par le stress oxydant directement au niveau des UsnRNP matures.
Domaines
Biochimie, Biologie Moléculaire| Origine | Fichiers produits par l'(les) auteur(s) |
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