Methodologies for Screening Metal-Chelating Peptides in Protein Hydrolysates for their Antioxidant Properties
Méthodologies de criblage des peptides chélateurs de métaux dans les hydrolysats de protéines pour leurs propriétés antioxydantes
Abstract
Currently, the discovery of new biomolecules is essential for various industrial applications. Peptides produced by hydrolysis of plant or animal proteins are of interest because of their potential bioactivities. Some peptides, by their ability to complex iron(II), can inhibit and slow down oxidation phenomena. To date, the discovery of new bioactive molecules is generally based on long and fastidious empirical approaches, involving large quantities of solvents, harmful to the environment. Therefore, it is important to develop new and highly sensitive screening methods before implementing a selective separation process of these peptides of interest present in mixture. The objective of this thesis is therefore to (i) develop highly sensitive screening methods to identify the presence of these metal chelating peptides (MCPs) in hydrolysates, produced in the laboratory, before undertaking a time-consuming separation phase and (2) to study their antioxidant activities, using biochemical and cellular assays. In the first approach, time-resolved molecular dynamics (switchSENSE) was first implemented on model peptides capable of complexing metals and then applied to non-filtrated soy and tilapia protein hydrolysates. It has proven to be very sensitive for detecting the presence of MCPs in peptide hydrolysates. This technology is based on the electrical movement of DNA strands, present on the surface of gold microelectrodes, on which are immobilized metal ions. When a peptide has an affinity for an immobilized metal ion and thus forms a peptide-metal complex, this results in a variation of the measured fluorescence signal. On the other hand, MCPs were screened in ultrafiltrated soy and pea protein hydrolysates using Surface Plasmon Resonance (SPR). This advanced technique, allows to determine an affinity constant between a peptide and a metal ion immobilized on a microchip at the molecular scale. It is used here in an original way to study different hydrolysates and thus screen the best hydrolysis condition to produce MCPs. The biological interest in exploring metal-chelating activity in these hydrolysates is to evaluate their antioxidant power in cellulo. These peptides could be promising for ferroptosis inhibition by chelating excess iron ions and thus contribute to the prevention of cell death in several diseases including Atherosclerosis (AS). We aimed to develop a ferroptosis model (induction and rescuing) on human aortic smooth muscle cells to mimic ferroptosis happening during AS development. The ferroptosis model was developed in three steps taking into consideration three essential parameters such as the concentration of ferroptosis inducers (Erastin and ferric ions), the time and the medium of incubation. At each step, 2 biomarkers i.e. intracellular concentration of GSH and lipid peroxidation were followed by NDA and TBARS methods, respectively. The rescue of the ferroptosis model was validated using metal chelators such as DFO and DFr, which are also control molecule regarding MCP activity.
Actuellement, la découverte de nouvelles biomolécules est primordiale pour diverses applications industrielles. Les peptides produits par hydrolyse de protéines végétales ou animales, présentent un intérêt en raison de leurs bioactivités potentielles. Certains peptides, par leur capacité à complexer le fer(II), peuvent inhiber les phénomènes d’oxydation. À ce jour, la découverte de nouvelles molécules bioactives est généralement basée sur des approches empiriques longues, et fastidieuses. Par conséquent, il est important de développer de nouvelles méthodes de criblage très sensibles avant de mettre en place un procédé de séparation sélectif de ces peptides d’intérêt présents en mélange. L’objectif de cette thèse est donc de (1) développer des méthodes de criblage à haute sensibilité pour identifier la présence de ces peptides chélateurs de métaux (PCMs) dans les hydrolysats, produits en laboratoire, avant d’entreprendre une phase séparative chronophage et (2) d’étudier leurs activités antioxydantes, à l’aide de tests biochimiques et cellulaires. Dans une première approche, ces PCM ont été criblés dans les hydrolysats de protéines de soja en utilisant une approche par Résonance Plasmonique de Surface (SPR). Cette technique permet de déterminer une constante d’affinité entre un peptide et un ion métallique immobilisé sur une micro-puce à l’échelle moléculaire. Elle est utilisé ici pour étudier différents hydrolysats et ainsi cribler la meilleure condition d'hydrolyse pour produire des PCMs. Avec ce même objectif, la dynamique moléculaire à résolution temporelle (switchSENSEⓇ) constitue une seconde approche basée sur un biocapteur et un suivi de fluorescence. Cette technologie est basée sur le mouvement électrique d'ADN, présents en surface de microélectrodes, sur lesquels sont immobilisés des ions métalliques immobilisés. Lorsqu’un peptide forme un complexe peptide-métal, cela entraîne une variation du signal de fluorescence mesuré. Cette méthode a d'abord été mise en place sur des PCMs de synthèse modèles, puis appliquée sur des hydrolysats de protéines de soja et Tilapia. Elle s’avère d’une très grande sensibilité pour détecter la présence de PCMs dans des hydrolysats. L'intérêt biologique d'explorer l'activité chélatrice de métaux dans ces hydrolysats est d'évaluer leur pouvoir antioxydant in cellulo. Ces peptides pourraient être prometteurs pour l'inhibition de la ferroptose en chélatant l'excès d'ion fer et ainsi contribuer à la prévention de la mort cellulaire dans plusieurs maladies dont l'athérosclérose (AS). Nous avons voulu développer un modèle de ferroptose (induction et sauvetage) sur des cellules musculaires aortiques humaines pour imiter la ferroptose qui se produit pendant le développement de l'AS. Le modèle de ferroptose a été développé en trois étapes en prenant en considération trois paramètres essentiels tels que la concentration des inducteurs de ferroptose (Erastin et ions ferriques), le temps et le milieu d'incubation. À chaque étape, 2 biomarqueurs, à savoir la concentration intracellulaire de GSH et la peroxydation lipidique, ont été suivis par les méthodes NDA et TBARS, respectivement. Enfin, le modèle de ferroptose a été validé lors d'une incubation de 10 µM d'Erastin et 50 µM d'ions ferriques pendant 1 nuit dans un milieu complet dilué 2 fois. L'Erastin a réussi à bloquer le système Xc- conduisant à la déplétion de la cystéine intracellulaire nécessaire à la synthèse du GSH. L'ajout d'ions ferriques a accéléré les réactions oxydatives, produisant des espèces réactives qui ont attaqué les membranes lipidiques des cellules et provoqué une peroxydation lipidique. Le sauvetage du modèle de ferroptose a été validé en utilisant des chélateurs de métaux tels que le DFO et le DFr, qui sont également des contrôles de l'activité des MCP. Seul la DFr à 150 µM a été capable d'inhiber la peroxydation lipidique provoquée par l'Erastin et l'ion ferrique.
Origin | Files produced by the author(s) |
---|