Monitoring de S-nitrosothiols dans des matrices biologiques grâce à des sondes nanostructurées - Université de Lorraine Access content directly
Theses Year : 2022

S-nitrosothiols monitoring in biological matrices by nanostructurated probes

Monitoring de S-nitrosothiols dans des matrices biologiques grâce à des sondes nanostructurées

Abstract

Thiols have a pivotal role in the biomedical and agri-food field. They are involved for example in redox homeostasis or many biologicals activities and as nitric oxide donors and carriers (formation of S-nitrosothiols). In fact, S-nitrosothiols (RSNO) increase NO half-life and transport to its action site. The understanding of RSH/RSNO pharmacodynamics and roles remains a real challenge for now. Indeed, strong reactivity (oxidation and reduction) of RSH, associated to a poor stability, lead to many possible reactions. However, their detection and quantification remain challenging. The decoding of RSH/RSNO role needs the development of a methodology of quantification in adequation with thiol properties.To overcome these shortcomings, nanomaterials associated methods were developed in connection with their optical properties and high reactivity towards thiols. Despite an increase of sensitivity (down to femtomolar) and thiol selectivity, the use of nanomaterial lead to stability issues. Thus, nanostructurated materials should be developed to avoid drawbacks of colloidal nanomaterials and should provide new properties to traditional materials.For this purpose, cellulosic membranes were nanostructurated with immobilized gold nanoparticles (AuNP) to selectively capture thiols. The device was coupled with an already validated HPLC-UV method developed for thiol identification and quantification, according to regulatory instances (ICH Q2R1) 1. These devices were first optimized and characterized in term of nanostructuration (number of embedded AuNP) and thiol adsorption/desorption with a two-step strategy based on near-covalent affinity between gold and thiol (40-50 kcal/mol).After a proof of concept study on two model thiols (N-acetylcysteine (NAC) and reduced glutathione (GSH)) and their S-nitrosated counterparts, the device was applied to follow RSNO permeability through an in vitro intestinal barrier model (Caco-2 cells in a Transwell® system). This led to a global identification and quantification of species involved in crossing barrier mechanisms. The device was also used for volatile thiols in different beverages using GC-MS quantification and identification.For the first time to our knowledge, a nanostructurated device was proposed for thiol capture, identification and quantification. This device was easy to handle overcame matrix effects and avoided pre-treatment steps. Moreover, the large concentration factor induced by this device allowed reaching LOD compatible with trace quantifications.
Les thiols jouent un rôle majeur dans le domaine biomédical et agroalimentaire. Ils sont impliqués par exemple dans l'homéostasie redox ou dans de nombreuses activités biologiques ainsi que comme donneurs et transporteurs d'oxyde nitrique (formation de S-nitrosothiols). En effet, les S-nitrosothiols (RSNO) augmentent la demi-vie du NO et son transport vers son site d'action. La compréhension de la pharmacodynamique et des rôles des RSH/RSNO reste pour l'instant un véritable défi. En effet, la forte réactivité (oxydation et réduction) des RSH, associée à une faible stabilité, conduit à de nombreuses réactions possibles. Cependant, leur détection et leur quantification restent un défi. Le décodage du rôle des RSH/RSNO nécessite le développement d'une méthodologie de quantification en adéquation avec les propriétés des thiols.Pour pallier à ces lacunes, des méthodes associées aux nanomatériaux ont été développées en lien avec leurs propriétés optiques et leur forte réactivité vis-à-vis des thiols. Malgré une augmentation de la sensibilité (jusqu'au femtomolaire) et de la sélectivité des thiols, l'utilisation de nanomatériaux a conduit à des problèmes de stabilité. Ainsi, des matériaux nanostructurés devraient être développés pour éviter les inconvénients des nanomatériaux colloïdaux et devraient apporter de nouvelles propriétés aux matériaux traditionnels.Dans ce but, des membranes cellulosiques ont été nanostructurées avec des nanoparticules d'or immobilisées (AuNP) pour capturer sélectivement les thiols. Le dispositif a été couplé à une méthode HPLC-UV déjà validée, développée pour l'identification et la quantification des thiols, conformément aux instances réglementaires (ICH Q2R1) 1. Ces dispositifs ont d'abord été optimisés et caractérisés en termes de nanostructuration (nombre de AuNP intégrés) et d'adsorption/désorption des thiols avec une stratégie en deux étapes basées sur l'affinité quasi-covalente entre l'or et le thiol (40-50 kcal/mol) 2.Après une étude de preuve de concept sur deux thiols modèles (N-acétylcystéine (NAC) et glutathion réduit (GSH)) et leurs homologues S-nitrosés, le dispositif a été appliqué pour suivre la perméabilité du RSNO à travers un modèle de barrière intestinale in vitro (cellules Caco-2 dans un système Transwell®). Ceci a conduit à une identification et une quantification globale des espèces impliquées dans les mécanismes de franchissement de la barrière. Le dispositif a également été utilisé pour les thiols volatils dans différentes boissons en utilisant la quantification et l'identification par GC-MS.Pour la première fois à notre connaissance, un dispositif nanostructuré a été proposé pour la capture, l'identification et la quantification des thiols. Ce dispositif, facile à manipuler, a permis de surmonter les effets de matrice et d'éviter les étapes de prétraitement. De plus, le grand facteur de concentration induit par ce dispositif a permis d'atteindre des LOD compatibles avec des quantifications de traces.
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Dates and versions

tel-04079982 , version 1 (24-04-2023)

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  • HAL Id : tel-04079982 , version 1

Cite

Margaux Berthou. Monitoring de S-nitrosothiols dans des matrices biologiques grâce à des sondes nanostructurées. Sciences pharmaceutiques. Université de Lorraine, 2022. Français. ⟨NNT : 2022LORR0253⟩. ⟨tel-04079982⟩
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