Biomimetic reactor : compartmentalizing and coupling the regeneration of the NAD(P)H cofactor and the biocatalytic oxidation of hydrogen - Université de Lorraine Access content directly
Theses Year : 2022

Biomimetic reactor : compartmentalizing and coupling the regeneration of the NAD(P)H cofactor and the biocatalytic oxidation of hydrogen

Réacteur biomimétique : compartimenter et coupler la régénération du cofacteur NAD(P)H et l’oxydation biocatalytique de l’hydrogène

Abstract

The regeneration of cofactors NADH and NADPH is an important topic in biotechnology because many redox enzymes, such as alcohol dehydrogenases, imine reductases, and P450 monooxgenases, require cofactor to deliver their redox equivalent. However, because cofactors are particularly expensive, supplying stoichiometric cofactor when these enzymes are used in chemical synthesis is not economically feasible. To address this issue, a number of cofactor regeneration systems have been developed. Traditional regeneration systems for reduced cofactors have drawbacks because most of them require a carbon-based sacrificial co-substrate reductant and produce a by-product that is likely to be burned as waste, impeding downstream product purification and lowering the atom economy.In this work, the implementation of redox biocatalysis in a flow reactor coupling separately hydrogen oxidation to NADH regeneration was developed. A hierarchization of the work was important in order to proceed with an efficient regeneration of NADH.First, in a redox flow bioreactor hybridized by a gas diffusion electrode for hydrogen oxidation, the electrochemically mediated regeneration of NADH by a dissolved Rhodium complex ([Cp*Rh(bpy)Cl]+) was implemented. Initially, the reactor was optimized in terms of concentrations of rhodium complex and NAD+ ([NAD+]/[Cp*Rh(bpy)Cl]+ = 40), the non-humidification of hydrogen gas, the flow rates of H2 gas and electrolytic solution (20 mL.min-1), and the pH of the solution (7.2).Secondly, in order to promote the best cycling of both the catalyst and the enzymatic cofactor and potentially easier purification of the synthesized molecules, the immobilization of the rhodium complex was proceeded on a carbon paper coated with MWCNT (Rh@CP-MWCNT). Rh@CP-MWCNT electrode was shown to be stable for periods of more than 5 days under flow conditions. Following that, the cofactor regeneration technique was applied to NADH-dependent biosynthesis using L-lactate dehydrogenase (LDH): the enzyme was immobilized on a separate layer placed approximately 50 µm from the Rh-CP-MWCNT matrix, and used in the flow cell. A cofactor concentration as low as 10 µM was found to be sufficient for the conversion of pyruvate with high faradaic efficiency (78 %) and total turnover number (TTN) levels of 1.8*104, 2.5*103, and 1.8*105 for the Rh complex, the NADH cofactor, and the LDH enzyme, respectively.On the other hand, to expand the study, chemical catalysts were exchanged by biological ones. FNR, Ferredoxin NADP+ reductase, replaced the Rh complex at the cathodic compartment.
La régénération des cofacteurs NADH et NADPH est un sujet important en biotechnologie car de nombreuses enzymes redox, telles que les alcools déshydrogénases, les imines réductases et les monooxgénases P450, ont besoin de cofacteur pour fournir leur équivalent redox. Cependant, comme les cofacteurs sont particulièrement coûteux, l'apport d'un cofacteur stœchiométrique lorsque ces enzymes sont utilisées en synthèse chimique n'est pas économiquement réalisable. Pour résoudre ce problème, un certain nombre de systèmes de régénération des cofacteurs ont été mis au point. Les systèmes traditionnels de régénération des cofacteurs réduits présentent des inconvénients car la plupart d'entre eux nécessitent un co-substrat réducteur sacrificiel à base de carbone et produisent un sous-produit susceptible d'être brûlé comme déchet, ce qui entrave la purification du produit en aval et réduit l'économie atomique. Dans ce travail, la mise en œuvre de la biocatalyse redox dans un réacteur à flux couplant séparément l'oxydation de l'hydrogène à la régénération du NADH a été développée. Une hiérarchisation des travaux était importante afin de procéder à une régénération efficace du NADH. Tout d'abord, dans un bioréacteur à flux redox hybridé avec une électrode à diffusion gazeuse pour l'oxydation de l'hydrogène, la régénération électrochimique du NADH par un complexe de rhodium dissous ([Cp*Rh(bpy)Cl] +) a été mise en œuvre. Initialement, le réacteur a été optimisé en termes de concentrations de complexe de rhodium et de NAD+ ([NAD+] /[Cp*Rh(bpy)Cl] + = 40), de non-humidification de l'hydrogène gazeux, de débits de H2 gazeux et de solution électrolytique (20 mL.min-1), et de pH de la solution (7,2). Deuxièmement, afin de promouvoir le meilleur cyclage du catalyseur et du cofacteur enzymatique et une purification potentiellement plus facile des molécules synthétisées, l'immobilisation du complexe de rhodium a été effectuée sur un papier carbone recouvert de nanotubes de carbone (Rh@CP-MWCNT). L'électrode Rh@CP-MWCNT s'est avérée stable pendant des périodes de plus de 5 jours dans des conditions de flux continu. Ensuite, la régénération de NADH a été couplée à la biosynthèse de pyruvate catalysée par la L-lactate déshydrogénase (LDH) : l'enzyme a été immobilisée sur une couche séparée et placée à environ 50 µm de la matrice Rh-CP-MWCNT. Une concentration de cofacteur de 10 µM s'est avérée suffisante pour la conversion du pyruvate avec une efficacité faradique élevée (78 %) et des niveaux de recyclage (TTN) de 1,8*104 , 2,5*103 et 1,8*105 pour le complexe de Rh, le NADH et la LDH, respectivement. D'autre part, pour élargir l'étude, les catalyseurs chimiques ont été remplacés par des catalyseurs biologiques. La FNR, Ferrédoxine NADP+ réductase, a ainsi remplacée le complexe de Rh au compartiment cathodique. Malgré le fait que le cofacteur NAD(P)+ soit réduit à un potentiel plus négatif (-0,7 V vs ref (H2)) que celui du complexe de Rh (-0,3 V vs ref (H2)), la FNR a démontré sa capacité à régénérer le NADPH et le NADH, et des niveaux élevés de TTN pour le cofacteur (10 000) ont été mesurés une fois couplée à la bioconversion du pyruvate catalysée par la LDH. De plus, l'échange du platine recouvrant l'électrode de diffusion gazeuse par l'hydrogénase, un biocatalyseur électroenzymatique, pour l'oxydation de l'hydrogène a été réalisé sur une couche de diffusion gazeuse qui a montré une efficacité envers l'oxydation de l'hydrogène qui a été couplée à la réduction de NAD+ catalysée par le complexe Rh dans un réacteur batch.
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  • HAL Id : tel-04087960 , version 1

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Wassim El Housseini. Biomimetic reactor : compartmentalizing and coupling the regeneration of the NAD(P)H cofactor and the biocatalytic oxidation of hydrogen. Chemical Sciences. Université de Lorraine, 2022. English. ⟨NNT : 2022LORR0160⟩. ⟨tel-04087960⟩
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