Identification et caractérisation des éléments fonctionnels associés à l’activité de régulateur génique du lncRNA pathogénique ANRIL - Université de Lorraine Access content directly
Theses Year : 2022

Identification and characterization of the functional elements associated with the gene regulation activities of the pathogenic lncRNA ANRIL

Identification et caractérisation des éléments fonctionnels associés à l’activité de régulateur génique du lncRNA pathogénique ANRIL

Abstract

The long non-coding RNAs (≥200nts, lncRNAs) are key players in the maintenance of cellular homeostasis, therefore it is not surprising that they are associated to a wide range of pathologies (Cancer, Cardiovascular pathologies…). Despite the growing number of lncRNAs (> 50 000) identified in Human, the molecular mechanisms governing their functions remain poorly characterized. The team initiated a project which aims at identifying and characterizing the functional elements (sequence, protein partners, post-transcriptional modifications) associated with the activities of the lncRNA ANRIL (Antisense non-coding RNA in the INK4 locus). Indeed, ANRIL is prone to regulate gene expression and is associated with multiple severe pathologies. Thus, ANRIL constitutes an ideal study model for which the functional characterization should provide a clearer vision of its activities especially in pathological conditions.My thesis project is divided into 2 axis:1/ Identification and characterization of the RNA elements and the protein partners important for ANRIL’s activity. Through combination of complementary approaches such as in silico sequences analysis, in vitro and in cellulo RiboNucleoProtein complexes purification (RIP and affinity chromatography), CRISPR/Cas9 cell lines engineering, transcriptomic analysis (microarray) and analysis of the chromatin landscape (Cut&Run), we identified hnRNPK as a novel protein partner of ANRIL likely to be involved in its regulatory activities. We also identified a functional domain in ANRIL enriched in repeated and transposable elements described to be implicated in different aspects of its function including subcellular localization, hnRNPK recruitment and PRC2-dependent gene regulation.2/ Identification and characterization of the post-transcriptional modifications associated with ANRIL’s activities. We initiated the development of an original RNA enrichment method coupled with RiboMethSeq analysis which identified 16 nucleotides likely to be 2’-O-methylated within the ANRIL’s sequence. In addition, we generated the tools suitable for identifying the enzymes responsible for the deposition of these modifications as well as for characterizing their functions associated with ANRIL.
Les longs ARN non-codants (≥200nts, lncRNA) sont essentiels au maintien de l’homéostasie cellulaire, il n’est donc pas surprenant qu’ils soient associés à de nombreuses pathologies (cancers, pathologies cardiovasculaire…). Malgré le nombre important de ces derniers (> 50 000) chez l’Homme, rares sont ceux caractérisés à l’échelle moléculaire. Il demeure en effet de nombreuses zones d’ombre concernant les mécanismes moléculaires régissant les activités des lncRNA. L’équipe a initié une étude visant à caractériser les éléments fonctionnels (séquence, partenaires protéiques, modifications post-transcriptionnelles) associés au lncRNA ANRIL (Antisense non-coding RNA in the INK4 locus), qui en plus d’être impliqué dans la régulation de l’expression génique est également associé aux maladies cardiovasculaires et celles à caractère tumoral. Le lncRNA ANRIL est donc un modèle d’étude particulièrement pertinent et sa caractérisation doit permettre d’appréhender plus clairement ses fonctions engagées notamment en conditions pathologiques.Ce projet de thèse se divise en 2 axes :1/ Identification et caractérisation des éléments ARN et des partenaires protéiques importants pour l'activité d'ANRIL. Par des approches complémentaires d’analyse in silico de séquence, de purification des complexes RiboNucléoProtéiques in vitro et in cellulo (RIP et chromatographie d’affinité), d’utilisation de lignées cellulaires éditées par l’approche CRISPR/Cas9, d’analyses transcriptomiques (microarray) et d’évaluation des changements du paysage chromatinien (Cut&Run), nous avons notamment identifié hnRNPK, un partenaire protéique d’ANRIL susceptible d’être important pour ses fonctions de régulateur génique. De plus l’analyse in silico des séquences exoniques d’ANRIL a révélé un enrichissement de l’exon 21 en éléments répétés et éléments dérivés de transposons (70 % de sa séquence). La caractérisation fonctionnelle de cette séquence particulière a notamment révélé son implication dans différents aspects de la fonction d’ANRIL incluant sa localisation subcellulaire, le recrutement d’hnRNPK et la régulation de l’expression génique dépendante du complexe PRC2.2/ Identification et caractérisation des modifications post-transcriptionnelles importantes pour l'activité d'ANRIL. La mise au point d’une méthode inédite d’enrichissement des ARN couplée à des analyses de RiboMethSeq a permis d’identifier 16 nucléotides candidats porteurs de méthylation en position 2’ au sein d’ANRIL. Cette étude a également permis de poser les premiers jalons nécessaires à l’identification des protéines à activité méthyltransférase responsables du dépôt de ces modifications et à l’évaluation de leurs fonctions dans les activités d’ANRIL.
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Dates and versions

tel-04195378 , version 1 (04-09-2023)

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  • HAL Id : tel-04195378 , version 1

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Cite

Aymeric Sanchez. Identification et caractérisation des éléments fonctionnels associés à l’activité de régulateur génique du lncRNA pathogénique ANRIL. Médecine humaine et pathologie. Université de Lorraine, 2022. Français. ⟨NNT : 2022LORR0328⟩. ⟨tel-04195378⟩
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