Impact of β1,3-galactosyltransferase 6 deficiency in rare connective tissue disorders
Impact de la déficience en β1,3-galactosyltransférase 6 dans une maladie génétique rare des tissus conjonctifs
Résumé
Proteoglycans (PG) are macromolecules found in cell plasma membranes and which are abundant in extracellular matrix (ECM) of connectives tissues (CT). They are composed of a core-protein onto which one or more glycosaminoglycan (GAG) chains are attached. They play multiple roles in collagen fibrillogenesis, the biomechanical properties of CT, and in other crucial biological processes such as cell signaling regulation. β1,3-galactosyltransferase 6 (β3GalT6) is a glycosyltransferase (GT) involved in the early steps of GAG chains biosynthesis. Spondylodysplastic Ehlers-Danlos syndrome (spEDS) is a rare and severe CT disorder caused by mutations in B3GALT6. It presents a wide range of musculoskeletal symptoms, overlapping with other osteochondrodysplasia making diagnosis challenging. The aim of this thesis is to gain new insights into the molecular mechanisms underlying spEDS, using a multiscale and multidisciplinary approach. A truncated, soluble form of β3GalT6 as well as three pathogenic variants were purified to characterize their kinetic parameters: the three variants cause a total loss of function. Using molecular dynamics, we have shown that mutations cause variations in the intensity of hydrogen bonds and salt bridges between residues belonging to conserved motifs. A decrease in the fluctuations of a loop is also observed when the enzyme is mutated. We propose that these parameters contribute to the loss of function. In an eucaryotic cell model invalidated for the B3GALT6 gene and in patients’ fibroblasts, we observed a drastic reduction but residual GAG chains synthesis. For the first time, we have shown in vitro that another enzyme of the pathway is responsible for this residual synthesis. However, the residual GAG synthesis is insufficient and leads to defective ECM synthesis. Finally, using a murine chondrogenic ATDC5 cell model, we studied the consequences of B3galt6 invalidation on the biomechanical properties of the ECM. A marked reduction in the glycosylation of type XII collagen (Col XII), was observed. This result highlights a possible pathogenic role of this matrix PG in spEDS. Using atomic force microscopy, we also associated the loss of function of β3GalT6 to the diminution of the matrix elasticity. Our work provides new insight into the pathogenesis of spEDS and is a step towards dissecting the molecular events responsible for this disease.
Les protéoglycanes (PG) sont des macromolécules présentes au niveau des membranes plasmiques cellulaires et abondantes au sein des matrices extracellulaires (MEC) des tissus conjonctifs (TC). Ils sont composés d’une partie protéique sur laquelle sont greffées une à plusieurs chaînes de glycosaminoglycanes (GAG) qui participent activement à la fibrillogenèse des collagènes, aux propriétés biomécaniques des TC et à de nombreux autres processus biologiques tels que la régulation des cascades de signalisation intra- et extracellulaires. La β1,3-galactosyltransférase 6 (β3GalT6) est une glycosyltransférase (GT) impliquée de façon précoce dans la biosynthèse des chaînes de GAG. Le syndrome d’Ehlers-Danlos spondylodysplasique (SEDsp) est une maladie génétique rare et sévère des TC due à des mutations du gène B3GALT6. Le spectre de symptômes musculo-squelettiques est large et associé à des difficultés de diagnostic. Ce travail de thèse vise à élucider les mécanismes moléculaires sous-jacents au SEDsp par une approche pluridisciplinaire à plusieurs échelles. Une forme tronquée et soluble de la β3GalT6 ainsi que trois variants pathogènes ont été purifiés dans le but de caractériser leurs paramètres cinétiques : les trois variants causent une perte totale de fonction. Par dynamique moléculaire, nous avons mis en évidence que les trois mutations sont à l’origine de variations d’intensités de liaisons hydrogène et de ponts salins entre des résidus faisant partie de motifs conservés des GT. Une diminution du taux de fluctuations d’une boucle est également observée lorsque l’enzyme est mutée. Nous proposons que ces paramètres contribuent à la perte de fonction. Dans un modèle cellulaire eucaryote invalidé pour le gène B3GALT6 et dans les fibroblastes de patients, nous avons observé une synthèse résiduelle des chaînes de GAG. Nous avons démontré in vitro qu’une autre GT de la synthèse, la glucuronosyltransferase I, est responsable de cette synthèse résiduelle. Toutefois, cette synthèse est insuffisante et conduit à la formation d’une MEC défectueuse. Enfin, grâce à un modèle cellulaire ATDC5 chondrogénique murin, nous avons étudié les conséquences d’une invalidation de B3galt6 sur les propriétés biomécaniques de la MEC. Nous avons relevé la forte diminution de la glycosylation du collagène de type XII, un PG matriciel, jouant un rôle potentiel dans la pathogénie du SEDsp. Nous relions également par microscopie à force atomique la perte de fonction de β3GalT6 à la diminution de l’élasticité de la MEC. Nos travaux apportent un nouveau regard sur la pathogénie du SEDsp et sont un pas vers la compréhension des évènements responsables de cette maladie.
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