Structural and functional characterization of enzymes involved in the maturation of pyrrolizidine alkaloids derived from NRPS pathways in pathogenic γ-proteobacteria
Caractérisation structurale et fonctionnelle d’enzymes impliquées dans la maturation d’alcaloïdes pyrrolizidiniques issus de voies NRPS chez des γ-protéobactéries pathogènes
Résumé
Bacterial pyrrolizidine alkaloids (PAs) are secondary metabolites of wide chemical diversity at the origin of their promising pharmacological properties (antibiotics, anticancer, etc.). Although it has been determined that the heterocyclic core is assembled by modular non-ribosomal peptide synthetases (NRPS), the molecular mechanisms which govern the structural variety of the products and underlie their biological activities remain unknown. Given the major interest of these biosynthetic systems, this project aims to establish the structure-function relationships of the XhpG hydrolase and the AzeD dehydratase involved in the post-NRPS maturation of intermediate PAs in the pathogenic γ-proteobacteria Xenorhabdus hominickii and Pseudomonas aeruginosa. In pursuit of this objective, the recombinant enzymes have been subjected to an integrative experimental strategy, from their heterologous expression within the host E. coli BL21 (DE3), in either a native or mutant form, up to their purification by liquid chromatography and subsequent analysis via dynamic light scattering. These steps have allowed to confirm the homogeneity and monodispersity of the obtained samples, conditions necessary for the in-depth structural characterization of the apo-proteins by X-ray crystallography. Therefore, the efforts undertaken in screening and refining crystallization conditions, as well as in acquiring diffraction data at atomic resolution (1.2-1.6 Å), have permitted to elucidate the three-dimensional structure of the target biosynthetic enzymes. In light of complementary analyses, these results have provided a general overview of plausible oligomeric and conformational states in solution, and also insights into the catalytic mechanism with a focus on substrate specificity. In due course, the obtained knowledge will contribute to biosynthetic engineering endeavors to generate azacyclic analogues with interesting therapeutic potential, specifically in fighting the opportunistic pathogen P. aeruginosa responsible for nosocomial infections on a global scale.
Les alcaloïdes pyrrolizidiniques (AP) bactériens sont des métabolites secondaires d’une grande diversité chimique à l’origine de leurs propriétés pharmacologiques prometteuses (antibiotiques, anticancéreux, etc.). Bien qu’il ait été déterminé que le noyau hétérocyclique soit assemblé par des méga-synthétases de peptides non-ribosomiques (NRPS) bimodulaires, les mécanismes moléculaires qui conditionnent la variété structurale des produits et sous-tendent leurs activités biologiques restent inconnus. Compte tenu de l’intérêt majeur de ces systèmes biosynthétiques, ce projet vise à établir les relations structure-fonction de l’hydrolase XhpG et de la déshydratase AzeD impliquées dans le processus de maturation post-NRPS des AP intermédiaires chez les γ-protéobactéries pathogènes Xenorhabdus hominickii et Pseudomonas aeruginosa. Dans cet objectif, les enzymes recombinantes ont fait l’objet d’une stratégie expérimentale intégrative, de leur expression hétérologue au sein de l’hôte E. coli BL21 (DE3), dans une forme native ou mutante, jusqu’à leur purification par chromatographie en phase liquide et analyse subséquente par diffusion dynamique de la lumière. Ces étapes ont permis de confirmer l’homogénéité et la monodispersité des échantillons obtenus, des conditions nécessaires à la caractérisation structurale approfondie des apo-protéines par cristallographie aux rayons X. Dès lors, les efforts entrepris dans le criblage et l’affinement des conditions de cristallisation, ainsi que dans l’acquisition de données de diffraction à résolution atomique (1,2-1,6 Å), ont permis de résoudre la structure tridimensionnelle des enzymes biosynthétiques d’intérêt. À la lumière d’analyses complémentaires, ces résultats ont fourni une vue globale des états oligomériques et conformationnels plausibles en solution, et également un aperçu du mécanisme catalytique avec un accent sur la spécificité de substrat. À terme, les connaissances obtenues contribueront aux travaux d’ingénierie biosynthétique afin de générer des analogues azacycliques avec un potentiel thérapeutique intéressant, en l’occurrence dans la lutte contre le germe opportuniste P. aeruginosa responsable d’infections nosocomiales à l’échelle mondiale.
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