Caractérisation moléculaire et biochimique de la formation du bois de coeur chez le noyer noir (Juglans nigra L.) : accumulation des flavonoïdes et expression des gènes contrôlant leur biosynthèse
Résumé
The main objective of this thesis was to identify genes controlling walnut wood quality. The fonnation of heartwood contributes to the natural colour and durability of wood. This physiological process was investigated at the biochemical and molecular levels in mature Juglans nigra trees. The temporal dynamics
of heartwood expansion, the accumulation of flavonoid extractives, and the expression of genes encoding enzymes of flavonoid pathway were studied in xylem sarnples from Juglans nigra stems. Protocols for RNA
extraction were optimised for very aged xylem sarnples and cDNA fragments corresponding to the genes under study were cloned from Juglans nigra xylem in order to obtain homologous probes. The comparison
arnong sarnples collected at different seasonal periods suggested that new heartwood is fonned mainly in the surnrner season. In ail of the trees studied, soluble phenolic extractives accumulated during ageing of xylem
growth rings. Flavanols strongly accumulated in the transition zone between sapwood and heartwood, suggesting that their biosynthesis was up-regulated concomitant to heartwood fonnation. The flavanol content in xylem correlated with the transcript levels of genes encoding the enzymes chalcone synthase
(CHS), flavanone 3-hydroxylase (F3H), and dihydroflavonol4-reductase (DFR) (flavonoid pathway). On the contrary, the expression patterns of genes encoding the enzymes phenylalanine arnrnonia-lyase (PAL), cinnarnate 4-hydroxylase (C4H), and 4-coumarate-CoA ligase (4CL) (general phenylpropanoid pathway) did
not correlate with the distribution of flavanols, even though PAL genes were strongly expressed in the transition zone. The comparison of transcript levels, protein pools, and catalytic activities of PAL and CHS
suggested that the activities of these enzymes might differ in the mode ofregulation. PAL activity would be regulated at the post-translation level, while CHS activity would be mainly regulated at the transcription level. The overall results indicate that in Juglans nigra trees flavanols are de novo synthesized in aged
xylem, especially during the transfonnation of sapwood into heartwood. Flavanol accumulation appeared to be regulated mainly at the transcription level by the expression ofgenes encoding CHS, F3H, and DFR.
Le principal objectif de cette thèse a été d'identifier les gènes contrôlant la qualité du bois de noyer. La formation du bois de coeur contribue à la couleur et la durabilité naturelle du bois. Ce processus physiologique a été étudié au niveau biochimique et moléculaire chez des arbres matures de Jugions nigra. La dynamique temporelle de l'expansion du bois de coeur, l'accumulation de flavonoïdes et l'expression des gènes codant pour les enzymes de la biosynthèse des favonoïdes ont été étudié à partir d'échantillons de xylème du tronc de Juglans nigra. Les protocoles pour l'extraction d'ARN ont été optimisés pour les
échantillons de xylème très âgés et des fragments d'ADNc correspondants aux gènes étudiés ont été clonés à partir du xylème de Juglans nigra afin d'obtenir des sondes homologues. La comparaison entre les échantillons collectés à différentes saisons suggère que le nouveau bois de coeur soit formé principalement en
été. Chez tous les arbres étudiés, des phénols solubles étaient accumulés durant le vieillissement des cernes de xylème. Des flavanols étaient fortement accumulés dans la zone de transition entre l'aubier et le bois de coeur, suggérant que leur biosynthèse soit activée en concomitance avec la formation du bois de coeur. Les
teneurs en flavanols dans le xylème corrélaient avec le niveau d'expression des gènes codant pour les enzymes chalcone synthase (CRS), flavanol 3-hydroxylase (F3R) et dihydroflavonol 4-reductase (DFR) (voie des f1avonoïdes). Au contraire, le patron d'expression des gènes codant pour les enzymes phénylalanine ammonia-Iyase (PAL), cinnamate 4-hydroxylase (C4R) et coumarate:CoA ligase (4CL) (voie générale des phénylpropanoïdes) n'étaient pas corrélés avec la distribution des flavanols bien que les gènes
PAL étaient fortement exprimés dans la zone de transition. La comparaison des niveaux des transcrits, des quantités de protéines et des activités catalytiques relatives à PAL et CRS suggérait que les activités de ces enzymes aient des différents modes de régulation. L'activité de la PAL pourrait être régulée au niveau post-transcriptionnel tandis que l'activité de la CRS serait principalement régulée au niveau transcriptionnel. L'ensemble des résultats indique que, chez Jugions nigro, les flavanols sont synthétisé de novo dans le xylème âgé, spécialement durant la transformation de l'aubier en bois de coeur. L'accumulation des flavanols
apparaît être régulée principalement au niveau transcriptionnel par l'expression des gènes codant pour la CRS, F3R et DFR.
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