Tomato phenolamides : development of a metabolic engineering approach to study their functions in planta, and evaluation of their biological activities
Les phénolamides de la tomate : développement d’une approche d’ingénierie métabolique pour l’étude de leurs fonctions in planta, et évaluation de leurs activités biologiques
Résumé
Phenolamides are a family of specialized metabolites that accumulate in a wide variety of plant species. They have functions in flower initiation, are involved in plant responses to stress, and they are part of the composition of the walls of pollen grains. In addition, their therapeutic bioactivity has been described as an antioxidant, anti-inflammatory, anti-microbial or anti-cancer molecule. Recent laboratory work has shown that the tomato produces phenolamides, especially when it is attacked by the pest Tuta absoluta. Their role in the defense of plants remains unclear. In this context, a first objective of my thesis was to modulate the composition of phenolamides in tomatoes in order to assess the consequences of this modulation on the functioning of the plant and its ability to defend itself. A second objective was to determine the therapeutic potential of these phenolamides identified in tomatoes, by screening tests for activity. A prerequisite for the generation of plants genetically modified for their capacity to synthesize phenolamides, has been to identify new genes controlling the accumulation of phenolamides in the plant. We have exploited our RNA Seq tomato bank and work in other Solanaceae. We have identified ten candidate genes, two of which code for transcription factors and eight for acyltransferases. The functional characterization of these candidates has so far not led to the identification of any new enzymatic function associated with the phenolamide pathway. This work should be continued by broadening the spectrum of substrate tested on the identified candidates and by targeting other candidate genes. To generate the genetically modified plants, I carried out a methodological work, in the laboratory, to develop transformation and regeneration protocols on the tomato species, and the gene editing technique, (CRISPR / cas9). The techniques developed lead to a high efficiency of transformation, whether in overexpression or in gene editing. We thus generated 94 lines of tomatoes in which the expression of the putrescine hydroxycinnamoyl transferase (PHT) genes responsible for the accumulation of caffeoylputrescine was modified upward or downward, as was the expression of the transcription factor solyc06g083900 .2 likely to be involved in the accumulation of a wider set of phenolamides. The plants obtained are now available for characterization work on their metabolic content and the physiological consequences of the modifications generated. We evaluated the therapeutic potential of some tomato phenolamides induced by the herbivory of T. absoluta. Obtaining pure molecules required the help of chemists. Among the molecules evaluated, caffeoylputrescine and kukoamine A exhibit moderate antibacterial activities against Staphylococcus aureus. The tests revealed the anti-inflammatory property of caffeoylputrescine on macrophage cells. This work confirms the therapeutic potential of phenolamides. They will be prosecuted for the evaluation of their anti-cancer properties.
Les phénolamides constituent une famille des métabolites spécialisés qui s’accumulent chez une grande diversité d’espèces végétales. Ils ont des fonctions dans l’initiation florale, interviennent dans les réponses des plantes à des stress, et ils entrent dans la composition des parois de grains de pollen. De plus, leur bioactivité thérapeutique a été décrite en tant que molécule anti-oxydante, anti-inflammatoire, anti-microbienne ou anti-cancéreuse. Des travaux récents du laboratoire ont montré que la tomate produit des phénolamides, notamment lorsqu’elle subit l’herbivorie du ravageur Tuta absoluta. Leur rôle dans la défense des plantes reste à instruire. Dans ce cadre, un premier objectif de ma thèse a été de moduler la composition en phénolamides chez la tomate afin d’évaluer les conséquences de cette modulation sur le fonctionnement de la plante et sa capacité à se défendre. Un second objectif a été de déterminer le potentiel thérapeutique de ces phénolamides identifiés chez la tomate, par des tests de criblage d’activité. Un préalable à la génération de plantes modifié génétiquement pour leur capacité de synthèse de phénolamides, a été d’identifier de nouveaux gènes contrôlant l’accumulation de phénolamides dans la plante. Nous avons exploité notre banque ARN Seq de tomate et des travaux chez d’autres solanacées. Nous avons identifié dix gènes candidats, dont deux codant pour des facteurs de transcription et huit pour des acyltransférases. La caractérisation fonctionnelle de ces candidats n’a, pour le moment, pas mené à l’identification de nouvelle fonction enzymatique associée à la voie des phénolamides. Ce travail devra être poursuivi en élargissant le spectre de substrat testés sur les candidats identifiés et en ciblant d’autres gènes candidats. Pour générer les plantes modifiées génétiquement, j’ai réalisé un travail de développement méthodologique volumineux, ayant nécessité de maitriser au laboratoire des protocoles de transformation et de régénération sur l’espèce tomate, et d’acquérir et maîtriser la technique d’édition de gène (CRISPR/cas9). La technique mise au point conduit à une forte efficacité de transformation, que ce soit en surexpression ou en édition de gène. Nous avons généré ainsi 94 lignées de tomates dont l’expression des gènes de putrescine hydroxycinnamoyl transférase (PHT) responsable de l’accumulation de caféoylputrescine, a été modifiée à la hausse ou à la baisse, tout comme l’expression du facteur de transcription solyc06g083900.2 susceptible d’être impliqué dans l’accumulation d’un ensemble plus large de phénolamides. Les plantes obtenues sont maintenant disponibles pour un travail de caractérisation de leur contenu métabolique et des conséquences physiologiques des modifications générées. Nous avons évalué le potentiel thérapeutique de quelques phénolamides de tomate induits par l’herbivorie de T. absoluta. L’obtention de molécules pures a demandé le concours de chimistes. Parmi les molécules évaluées, la caféoylputrescine et la kukoamine présentent des activités antibactériennes modérées vis-à-vis de Staphylococcus aureus. Les tests ont révélé la propriété anti-inflammatoire de la caféoylputrescine sur des cellules de macrophage. Ces travaux confirment le potentiel thérapeutique des phénolamides. Ils seront poursuivis en vue de l’évaluation de leurs propriétés anti-cancéreuses.
| Origine | Fichiers produits par l'(les) auteur(s) |
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