Pharmacological and functional characterization of angiotensin II AT1 receptor tracer ligands for the study of new therapeutic approaches
Caractérisation pharmacologique et fonctionnelle de ligands traceurs du récepteur AT1 de l’angiotensine II pour l’étude de nouvelles approches thérapeutiques
Résumé
The renin-angiotensin system (RAS) is a hormonal system involved in many physiological processes, such as the control of arterial pressure and vascular homeostasis. Angiotensin II (Ang II) is the main effector of the RAS and binds with a similar affinity to two receptors: the Ang II type 1 (AT1) and type 2 (AT2) receptors, both belonging to the G protein-coupled receptor (GPCR) family. In most pathophysiological situations, AT1 activation, which stimulates the Gq signaling pathway, is predominant and deleterious. It opposes the beneficial effects induced by AT2. The development of biased AT1 agonists, such as TRV027, able to selectively activate the β-arrestin transduction pathway rather than the Gq pathway, appears promising and could lead to new therapeutic strategies compared to current therapies based on AT1 antagonists such as losartan.The objective of the research team is to explore this potentially beneficial β-arrestin pathway in a cerebrovascular physiological and physiopathological context, such as in stroke. β-arrestin activation can be monitored by following AT1 receptor internalization consecutive to its activation, however the tools needed to track and trace endogenously expressed AT1, in particular at the tissue level, notoriously lack specificity.The experimental work presented in this thesis focuses on the pharmacological characterization of new AT1-specific fluorescent ligands developed with the aim of studying AT1 signaling pathways in cerebrovascular models. Using HEK 293 cellular models overexpressing either AT1 or AT2 fused to fluorescent or luminescent proteins, we have characterized the pharmacology and selectivity of these new ligands. Agonist activity on AT1 receptors is determined by detecting intracellular calcium mobilization induced by the activation of the Gq signaling pathway. Recruitment of heterotrimeric G proteins and β-arrestins is assessed using bioluminescence resonance energy transfer (NanoBRET) assays. Internalization kinetics are followed by NanoBRET and imaging to visualize the subcellular distribution of the fluorescent ligands and their colocalization with target receptors. The fluorescent ligands have also been characterized ex vivo on isolated rat middle cerebral arteries.Fluorescent derivatives of Ang II, TRV027 and losartan were studied. For the first time, an AT1 receptor-selective fluorescent ligand and an AT2 receptor-selective fluorescent ligand have been characterized. The characterized fluorescent ligands could be used to track AT1 and/or AT2 receptors and to determine, for example, the mechanisms involved in the abolition of the vasoconstrictor activity of AT1 following treatments with nitric oxide donor
Le système rénine-angiotensine (SRA) est un système hormonal impliqué dans de nombreux processus physiologiques, tels que le contrôle de la pression artérielle et l’homéostasie vasculaire. L’Angiotensine II (Ang II) est le principal effecteur du SRA et se lie avec une affinité similaire à deux récepteurs : les récepteurs à l’Ang II de type 1 (AT1) et de type 2 (AT2), tous deux appartenant à la famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). Dans la plupart des situations physiopathologiques, l’activation d’AT1, qui stimule la voie de signalisation Gq, est prédominante et délétère. Elle s’oppose aux effets bénéfiques induits par AT2. Le développement d’agonistes AT1 biaisés, comme le TRV027, capables d’activer sélectivement la voie de signalisation β-arrestine plutôt que la voie Gq, apparait prometteur et pourrait conduire à de nouvelles stratégies thérapeutiques par rapport aux thérapies actuelles basées sur des antagonistes de AT1 tel que le losartan.L’objectif de l’équipe de recherche est d’explorer cette voie potentiellement bénéfique de la β-arrestine dans un contexte physiologique et physiopathologique cérébrovasculaire, comme lors d'un Accident Vasculaire Cérébral. L'activation de la β-arrestine peut être surveillée en suivant l'internalisation du récepteur AT1 consécutive à son activation, mais les outils nécessaires pour suivre et tracer AT1 exprimé de manière endogène, en particulier au niveau tissulaire, manquent notoirement de spécificité.Les travaux expérimentaux présentés dans cette thèse se concentrent sur la caractérisation pharmacologique de nouveaux ligands fluorescents développés dans l’optique d’étudier les voies de signalisation AT1 dans des modèles cérébrovasculaires. En utilisant des modèles cellulaires HEK 293 surexprimant les récepteurs AT1 ou AT2 fusionnés à des protéines fluorescentes ou luminescentes, nous avons caractérisé la pharmacologie et la sélectivité de ces nouveaux ligands. L’activité agoniste sur les récepteurs AT1 est déterminée en détectant la mobilisation du calcium intracellulaire induite par l’activation de la voie de signalisation Gq. Le recrutement des protéines G hétérotrimériques et des β-arrestines est évalué à l’aide de tests de transfert d’énergie par résonance bioluminescente (NanoBRET). Les cinétiques d’internalisation sont suivies par NanoBRET et par imagerie afin de visualiser la distribution subcellulaire des ligands fluorescents et leur colocalisation avec les récepteurs cibles. Les ligands fluorescents sont également caractérisés ex vivo sur des artères cérébrales moyennes isolées de rat.Des dérivés fluorescents de l’Ang II, de TRV027 et du losartan ont été étudiés. Pour la première fois, un ligand fluorescent sélectif des récepteurs AT1 et un ligand fluorescent sélectif des récepteurs AT2 ont été caractérisés. Les ligands fluorescents caractérisés pourront être utilisés pour suivre les récepteurs AT1 et/ou AT2 et pour déterminer, par exemple, les mécanismes impliqués dans l’abolition de l’activité vasoconstrictrice de AT1 suite aux traitements par des donneurs de monoxyde d’azote